陳紀(jì)鵬， 劉小林， 李生強(qiáng)， 劉顯軍， 胡月清， 陳 桃

(宜春學(xué)院 生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西省作物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 宜春 336000)

蕓薹屬(Brassica)植物屬于十字花科(Brassicaceae)，原生于西歐、環(huán)地中海地區(qū)，以及亞洲的溫帶地區(qū)，種類(lèi)繁多，包括多種重要的農(nóng)業(yè)園藝作物。甘藍(lán)型油菜(B.napus， AACC，2n=38)是蕓薹屬中一種重要的油料作物，它起源于歐洲，主要分布于北半球。由全基因組測(cè)序結(jié)果推測(cè)，甘藍(lán)型油菜大約起源于7 500年前，是由白菜型油菜(B.campestris，AA，2n=20)和甘藍(lán)(B.oleracea，2n=18，CC)天然雜交，并經(jīng)過(guò)染色體組自然加倍形成的異源四倍體[1]。甘藍(lán)型油菜具有自交親和性強(qiáng)、角果大、株型高大重疊、分枝部位高、主根發(fā)達(dá)、抗旱性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[2]，自20世紀(jì)30年代引入我國(guó)后，逐漸代替原有栽培品種大面積種植。但由于栽培年限較短、遺傳育種定向選擇等原因，當(dāng)前我國(guó)栽培的甘藍(lán)型油菜遺傳基礎(chǔ)比較狹窄，遺傳多樣性匱乏[3-4]。

早熟油菜是甘藍(lán)型油菜遺傳改良的重要種質(zhì)資源。長(zhǎng)江中下游是我國(guó)冬油菜主產(chǎn)區(qū)，每年油菜種植面積和產(chǎn)量占全國(guó)總面積和總產(chǎn)量的90%。這一地區(qū)一直采用雙季稻種植模式，但當(dāng)前種植的油菜品種由于生育期較長(zhǎng)、茬口銜接困難，直接影響了冬油菜的大面積推廣，致使較多田塊冬季閑置。因此，生產(chǎn)上亟須培育株型緊湊、生育期短的油菜品種。

白菜型油菜在我國(guó)有著悠久的栽培歷史，形成了多個(gè)亞種、變種和品種[5]。白菜型油菜具有生育期短、耐貧瘠、耐旱、耐寒等優(yōu)良特性[6]。黃芽白(B.campestrisssp. pekinensis)屬于白菜型油菜，抗寒性極高，種植歷史悠久，自交親和性也比較高，而且有早熟的特性。

甘藍(lán)型油菜與其近緣種間的雜交可以有效地利用近緣種的優(yōu)良基因。利用人工雜交，人們創(chuàng)造了大量的新型蕓薹屬種間、屬間雜種，為甘藍(lán)型油菜的遺傳改良提供了遺傳資源[7-8]。通過(guò)甘藍(lán)型油菜和白菜型油菜雜交來(lái)豐富油菜的遺傳資源，現(xiàn)已成為甘藍(lán)型油菜遺傳改良的重要途徑[9-10]。將甘藍(lán)型油菜與具有不同抗旱性的白菜型油菜雜交發(fā)現(xiàn)，雜種后代的抗旱性與其親本存在正相關(guān)性，說(shuō)明白菜型油菜的抗旱特性可向雜種后代傳遞[11]。甘藍(lán)型油菜與白菜型油菜的雜種后代經(jīng)過(guò)多代自交，可選擇到包含全套甘藍(lán)型油菜染色體組且具有甘藍(lán)型油菜表型的后代。分子標(biāo)記檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，這些雜種后代含有白菜型油菜基因的滲入。這也表明，通過(guò)種間雜交可將白菜型油菜的優(yōu)良基因?qū)敫仕{(lán)型油菜[12]。有限生長(zhǎng)花序是埃塞俄比亞芥的典型特征，研究人員在甘藍(lán)型油菜與埃塞俄比亞芥的雜交后代中選擇到了具有有限生長(zhǎng)花序的雜種后代，為培養(yǎng)有限生長(zhǎng)花序的甘藍(lán)型油菜創(chuàng)造了新的種質(zhì)資源[13]。白菜型油菜亞種間的雜種后代植株葉型、株型，以及花的形態(tài)都表現(xiàn)雙親的中間型，植株表現(xiàn)出較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)，而且花粉育性和結(jié)實(shí)性都較好[14]。甘藍(lán)型油菜與芥菜型油菜雜種一代和雜種二代都出現(xiàn)染色體數(shù)目不同的植株，花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂出現(xiàn)染色體的異源聯(lián)會(huì)，以及染色體的不均等分離等現(xiàn)象，而且在減數(shù)分裂結(jié)束時(shí)有部分花粉母細(xì)胞形成了五分孢子[15]。

本研究采用人工去雄和輔助授粉的方法對(duì)白菜型油菜與甘藍(lán)型油菜進(jìn)行雜交，分析雙親的雜交親和性，以及雜種后代的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)特征，旨在將白菜型油菜的優(yōu)良性狀引入甘藍(lán)型油菜，創(chuàng)造新的油菜種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

以甘藍(lán)型油菜湘油15(B.napuscv. Xiangyou 15，AACC，2n=38)與白菜型油菜黃芽白(B.campestrisssp. pekinensis，AA，2n=20)為親本進(jìn)行正反交，兩親本均為經(jīng)多代自交形成的純合群體。黃芽白生育期比甘藍(lán)型油菜短20～30 d，開(kāi)花較早，是適用于甘藍(lán)型油菜早熟育種的種質(zhì)資源。湘油15是由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)培育的半冬性甘藍(lán)型油菜品種。

于2017年10月上旬將湘油15種植于田間，黃芽白晚播15 d，使二者花期相遇。第二年春季油菜盛花期利用人工去雄、輔助授粉方法進(jìn)行雜交。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人工雜交和花粉萌發(fā)觀察

將湘油15與黃芽白進(jìn)行正反交。在母本的盛花期，人工剝除雄蕊后套上紙袋。第二天上午油菜散粉最旺盛的時(shí)間，摘取當(dāng)天開(kāi)放的父本花朵，對(duì)去雄的母本的花朵柱頭進(jìn)行人工授粉，完成后再套上紙袋。分別于授粉6、12、24、48 h后，取部分母本花蕾雌蕊，先用FAA溶液(體積分?jǐn)?shù)38%的甲醛溶液5 mL、冰醋酸5 mL、體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液90 mL混合制得)進(jìn)行固定處理，再用6 mol·L-1的NaOH溶液浸泡，使其變得更加透明，12 h后取出用水洗凈，最后用含有0.14%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))K2HPO4的水溶性苯胺藍(lán)溶液染色24 h以上。將染色的子房置于載玻片上，用80i型熒光顯微鏡(日本尼康)觀察花粉管萌發(fā)、伸長(zhǎng)情況。其余授粉花蕾繼續(xù)生長(zhǎng)，套袋7 d后去掉紙袋，待種子成熟后采收。

1.2.2 雜種后代花粉育性觀察

在油菜的盛花期，摘取雜種后代花朵觀察花粉育性。取下花藥放在載玻片上，滴加醋酸洋紅染色劑，用鑷子擠壓花藥，將花粉粒擠出，并將花藥壁清除干凈，蓋上蓋玻片，置于熒光顯微鏡下觀察：能被染色且呈圓形的花粉為可育的，染色淺且不飽滿的為不可育花粉。

1.2.3 細(xì)胞學(xué)觀察

為進(jìn)行花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂觀察和染色體計(jì)數(shù)，在雜種植株盛花期取幼小花蕾直接用卡諾固定液(無(wú)水乙醇、冰乙酸以體積比3∶1的比例混合)固定，處理24 h以上，再轉(zhuǎn)入體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液中，放入-20 ℃冰箱貯藏備用。在進(jìn)行染色體觀察前，將花藥在1 mol·L-1的HCl溶液中60 ℃水浴加熱酸解處理2 min，然后取出用清水漂洗，去除殘留的HCl。將酸解后的花藥在載玻片上破碎，滴加卡寶品紅染色，蓋上蓋玻片并用力擠壓，在顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芽白與湘油15的雜交親合性

觀察發(fā)現(xiàn)：在以湘油15為母本、黃芽白為父本的正交組合中，授粉后6 h，母本柱頭有大量花粉開(kāi)始萌發(fā)，花粉管生長(zhǎng)正常，12 h后便可觀察到有花粉管伸長(zhǎng)至胚珠部位；但在以黃芽白為母本、湘油15為父本的反交組合中，母本柱頭上的花粉萌發(fā)量少，6 h后只有不到10%的花粉萌發(fā)產(chǎn)生花粉管，且后期花粉管生長(zhǎng)緩慢，24 h后僅觀察到有少部分花粉管能伸長(zhǎng)至胚珠。

所獲得的雜種一代植株均具有29條染色體，但經(jīng)自交形成的雜種二代植株染色體數(shù)在25～27。在以湘油15為母本、黃芽白為父本的正交組合中，授粉后的角果發(fā)育健壯，授粉子房大部分都能形成角果，角果內(nèi)形成的籽粒數(shù)量為1～3粒，平均每個(gè)角果形成1.67粒種子(表1)。將收獲的種子種于田間，經(jīng)鑒定，有45%為真雜種。在以黃芽白為母本、湘油15為父本的反交組合中，大部分角果授粉后發(fā)育緩慢，胚珠不能正常膨大，慢慢停止生長(zhǎng)，不能形成帶種子的角果。只有少數(shù)(10%)的有胚珠膨大產(chǎn)生種子，而且還有較多不飽滿種子?？偟膩?lái)看，反交組合以較低的親和指數(shù)獲得雜種后代(F1′)，與正交組合差異極顯著(P<0.01)。

表1 黃芽白與湘油15雜種后代的雜交親和性

2.2 黃芽白與湘油15雜種后代的形態(tài)學(xué)特征

以湘油15為母本的正交組合，雜種一代F1的葉片形態(tài)大小、葉片顏色和母本類(lèi)似(圖1)，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛，植株高大，分枝多，產(chǎn)生大量角果，一級(jí)分枝數(shù)比父本多，與母本接近，且分枝位置較高。成熟期雜種植株高于雙親，與母本相比差異極顯著(P<0.01)，花朵黃色，較大，開(kāi)花期也比較長(zhǎng)，花藥發(fā)育不良，雄蕊較短。

正反交組合的雜種一代在花粉育性上差異不顯著，可育花粉比例接近50%，形成的角果比父本和母本都要多，但大部分角果不發(fā)育，不形成種子，發(fā)育的角果內(nèi)籽粒個(gè)數(shù)也較少，而且還有較多不飽滿種子。

反交組合F1′總體形態(tài)與F1相似，但是與F1相比株高較小，分枝數(shù)量較少，角果數(shù)量少，而且單株形成的種子數(shù)量也較少(表2)。

經(jīng)雜種一代F1和F1′自交分別產(chǎn)生雜種二代F2和F2′，在形態(tài)學(xué)方面，其與雜種一代極其相似，植株高度、分枝數(shù)量、每株產(chǎn)生角果數(shù)量都與親代接近。無(wú)論是正交還是反交組合的雜種二代，可育花粉比例均極顯著(P<0.01)增加，而且由于花粉育性恢復(fù)，植株結(jié)實(shí)率與雜種一代相比也極顯著(P<0.01)提高。

2.3 黃芽白與湘油15雜種后代花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂染色體行為

在雜種一代中，F(xiàn)1和F1′體細(xì)胞的染色體數(shù)量均為29，包括來(lái)自甘藍(lán)型油菜親本的19條染色體和來(lái)自白菜型油菜親本的10條染色體，未發(fā)現(xiàn)其他染色體數(shù)目的植株后代。在雜種二代中，出現(xiàn)了不同染色體數(shù)目的植株，染色體數(shù)目最少的只有25條，最多的有27條。

在花粉母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂前期，大部分花粉母細(xì)胞中的染色體主要形成二價(jià)體或單價(jià)體，也發(fā)現(xiàn)部分染色體聯(lián)會(huì)形成三價(jià)體。除了在雜種一代正交組合F1中，其他3個(gè)群體(F1′、F2、F2′)還發(fā)現(xiàn)有少部分花粉母細(xì)胞形成四價(jià)體等聯(lián)會(huì)形式。由此推測(cè)，花粉母細(xì)胞在減數(shù)分裂過(guò)程中部分染色體發(fā)生了非同源聯(lián)會(huì)(表3)。

伴隨花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂前期有單價(jià)體未參與染色體聯(lián)會(huì)，在第一次減數(shù)分裂中期和后期出現(xiàn)較多染色體落后現(xiàn)象。在第一次減數(shù)分裂中期，約40%的花粉母細(xì)胞所有染色體都整齊地排列在細(xì)胞中央，沒(méi)有染色體落后現(xiàn)象出現(xiàn)；而在其他花粉母細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)有1～4個(gè)染色體未與其他染色體一起排列在細(xì)胞中央，而是分布在其他區(qū)域。在第一次減數(shù)分裂后期，在大約30%的花粉母細(xì)胞中出現(xiàn)落后的染色體，落后染色體數(shù)目最多的達(dá)到3個(gè)。在第一次減數(shù)分裂和第二次減數(shù)分裂后期，都有少數(shù)花粉母細(xì)胞形成染色體橋。以上染色體落后現(xiàn)象在雜種一代和雜種二代中均有出現(xiàn)，而且出現(xiàn)頻率無(wú)顯著差異。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，白菜型油菜與甘藍(lán)型油菜雜交時(shí)，以甘藍(lán)型油菜為母本時(shí)的雜交親和性比反交組合好，更易獲得雜種后代。正反交所產(chǎn)生的雜種后代在表型、花粉育性和結(jié)實(shí)性等方面沒(méi)有顯著差異。經(jīng)自交產(chǎn)生的雜種二代花粉育性和結(jié)實(shí)性有明顯提高。雜種一代和雜種二代的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂出現(xiàn)較多異常，染色體聯(lián)會(huì)期除形成二價(jià)體外，還形成較多單價(jià)體，同時(shí)還有少數(shù)花粉母細(xì)胞形成三價(jià)體、四價(jià)體等多價(jià)體，分裂后期常有落后染色體和染色體橋出現(xiàn)。可以推測(cè)，異常的減數(shù)分裂是雜種后代花粉敗育的一個(gè)原因。

遠(yuǎn)緣雜交親合性不但受雙親親緣關(guān)系和基因型的影響，而且還受環(huán)境條件的影響。采用適當(dāng)?shù)碾s交方法，輔以相應(yīng)的生物技術(shù)手段，可以提高雜交的親合性。本研究以白菜型油菜黃芽白與甘藍(lán)型油菜湘油15為親本進(jìn)行正反交實(shí)驗(yàn)，采用人工去雄授粉方式獲得雜種后代。以黃芽白作母本、湘油15作父本時(shí)雜交親和性差；以湘油15作母本、黃芽白作父本時(shí)，雜交親和性較好，結(jié)出的種子較多且飽滿，獲得雜種后代的比率較高。黃芽白為母本親和性差的原因有多種可能：外界環(huán)境因素是影響油菜遠(yuǎn)緣雜交親和性的因素之一，本實(shí)驗(yàn)以黃芽白為母本雜交授粉期間遇陰雨天氣，且氣溫較低，可能導(dǎo)致雜交的親和性數(shù)據(jù)偏低。在甘藍(lán)型油菜與芥菜型油菜的雜交中也出現(xiàn)雜交親合性受環(huán)境條件影響的現(xiàn)象，相對(duì)較長(zhǎng)的日照時(shí)間和較高的溫度有利于雜交成功[16]。正反交中親本的選擇也可能是引起雜交親合性不同的原因，而且其對(duì)遠(yuǎn)緣雜交親和性的影響占主導(dǎo)作用。用染色體數(shù)量少的黃芽白作母本時(shí)就會(huì)出現(xiàn)親和性差的現(xiàn)象，而以染色體數(shù)量多的湘油15作母本進(jìn)行雜交時(shí)親和性就比較好。

植物種屬間的遠(yuǎn)緣雜種往往出現(xiàn)育性下降、結(jié)實(shí)率低等現(xiàn)象。導(dǎo)致雜種育性下降的遺傳因素很多，而減數(shù)分裂的異常是其中的一個(gè)重要原因。本研究發(fā)現(xiàn)，花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中染色體聯(lián)會(huì)除了形成二價(jià)體外，還出現(xiàn)較多的單價(jià)體、多價(jià)體。在減數(shù)第一次分裂和第二次分裂的后期都發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞出現(xiàn)落后染色體和后期染色體橋，同時(shí)還觀察到減數(shù)第一次分裂后期染色體不均等分離的現(xiàn)象。遠(yuǎn)緣雜種花粉育性下降與花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂同時(shí)發(fā)生。在埃塞俄比亞芥與白菜的三基因組(ABC)遠(yuǎn)緣雜種中也發(fā)現(xiàn)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂嚴(yán)重異常的現(xiàn)象，基因組之間染色體聯(lián)會(huì)的現(xiàn)象也比較常見(jiàn)，而且在后期也有較多細(xì)胞出現(xiàn)落后染色體和染色體橋，有的減數(shù)分裂細(xì)胞出現(xiàn)偏分離現(xiàn)象，形成大小不等的小孢子[17]。在合成蕓薹屬六倍體雜種的減數(shù)分裂觀察中也發(fā)現(xiàn)不同類(lèi)型的染色體異常聯(lián)會(huì)和后期染色體不均等分離等情況，而且發(fā)現(xiàn)不正常的減數(shù)分裂與雜種染色體組的穩(wěn)定性有關(guān)[18]。

白菜與甘藍(lán)雜交人工合成的AACC甘藍(lán)型油菜常表現(xiàn)出豐富的變異，出現(xiàn)許多新的性狀，比如花的形態(tài)與大小、開(kāi)花時(shí)間早晚、葉片表面的蠟質(zhì)特征，以及葉片形態(tài)等[19]。具有黃籽性狀的甘藍(lán)型油菜通過(guò)種間雜交成功獲得[20]。通過(guò)種屬間的雜交，雙親的遺傳物質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)移，有時(shí)發(fā)生整條染色體甚至整個(gè)染色體組的大規(guī)模轉(zhuǎn)移，有時(shí)則發(fā)生零星的染色體片段滲入。遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移勢(shì)必引起雜種后代相應(yīng)性狀的變化，這是當(dāng)前進(jìn)行植物遺傳改良常用的方法。遠(yuǎn)緣雜交后代中，伴隨著遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和遺傳物質(zhì)的改變，有利的農(nóng)藝性狀也隨之發(fā)生轉(zhuǎn)移。本研究在對(duì)雜種后代進(jìn)行遺傳分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，雖然雜種后代整體性狀極似甘藍(lán)型油菜，但某些性狀卻也表現(xiàn)出白菜型油菜的特征。