李國蕓，錢旭東，王 碩，吳美美，龐桂芬

（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，河北承德 067000）

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)等多學(xué)科理論，運(yùn)用各種組學(xué)、高通量篩選、網(wǎng)絡(luò)可視化和網(wǎng)絡(luò)分析等多種技術(shù)，揭示“藥物－基因－靶點(diǎn)－疾病”之間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，從多維度視角理解疾病的分子基礎(chǔ)，預(yù)測藥物的藥理學(xué)機(jī)制[1]。

目前新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019,COVID-19）在全球爆發(fā)，該病毒傳染性強(qiáng)、潛伏期長、人群普遍易感，截止至2020年5月26日，全球累計(jì)確診新冠病例逼近550萬，累計(jì)死亡病例超34.6萬例。目前該病尚無特效藥物進(jìn)行針對性治療。在新冠肺炎的臨床治療中，中醫(yī)中藥彰顯了良好的治療效果，且能夠與西醫(yī)治療聯(lián)合應(yīng)用，提高治療效果。

在國家衛(wèi)健委發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》中，將喜炎平注射液列為重型患者的推薦用藥。喜炎平注射液主要中藥成分是穿心蓮內(nèi)酯總酯磺化物，目前它用于治療新冠肺炎的機(jī)制尚不明確，有研究證實(shí)，喜炎平注射液具有清熱解毒止咳止痢的作用，可用于急性病毒性呼吸道感染、病毒性流感、急慢性支氣管炎、肺炎、高熱等治療，具有抗炎、抗病毒、抗菌、提高免疫等作用[2]。本文擬利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討中草藥穿心蓮的作用機(jī)制，為進(jìn)一步揭示喜炎平的作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 穿心蓮主要活性成分收集和靶點(diǎn)預(yù)測

應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫（https://tcmspw.com）進(jìn)行檢索，以“穿心蓮”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，設(shè)定口服利用度（oral availability,OB）≥30%，類藥性（drug-likeness,DL）≥0.18篩選該藥的活性成分。接著在TCMSP數(shù)據(jù)庫中將篩選出的活性成分對應(yīng)的蛋白，并應(yīng)用Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://sparql.uniprot.org）搜索靶點(diǎn)蛋白相對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)基因名，搜索時(shí)篩選已經(jīng)經(jīng)過驗(yàn)證的人源型基因，對得到的結(jié)果去掉重復(fù)基因。

1.2 收集疾病靶點(diǎn)信息

以“novel coronavirus pneumonia”為關(guān)鍵詞，應(yīng)用Gene Cards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org）搜索新型冠狀病毒肺炎的疾病靶點(diǎn)。將疾病靶點(diǎn)與藥物活性成分對應(yīng)的靶蛋白取交集，獲得治療新冠肺炎的治療靶點(diǎn)。

1.3 藥物成分-靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藥物活性成分、治療靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape-v3.8.0進(jìn)行可視化分析，得出藥物活性成分-靶點(diǎn)之間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，以獲得可能起主要治療作用的藥物成分和靶點(diǎn)；將治療靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org），設(shè)定物種：人源，設(shè)定最小的相互作用分?jǐn)?shù)：medium confidence （0.40），去除游離的節(jié)點(diǎn)。獲得蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，以研究藥物對應(yīng)的靶蛋白與疾病靶點(diǎn)之間的相互作用。

1.4 KEGG功能富集分析

為獲得治療靶點(diǎn)的作用機(jī)制，研究其生物學(xué)過程、分子功能及信號(hào)通路，利用metascape數(shù)據(jù)庫（https://metascape.org）和DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov）對治療靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行功能富集分析，并運(yùn)用在線繪圖工具bioinformatics（http://www.bioinformatics.com.cn）對所得到的結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 穿心蓮的活性成分及對應(yīng)的靶蛋白

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，以中藥“穿心蓮”為關(guān)鍵詞檢索藥物成分，得到化合物共49個(gè)；設(shè)定OB≥30%，DL≥0.18進(jìn)行篩選，得出活性成分24個(gè)，按照OB從小到大進(jìn)行排序（見表1），與之對應(yīng)的靶蛋白66個(gè)（刪除重復(fù)基因，見表2）。

表1 穿心蓮活性成分表

表2 藥物活性成分對應(yīng)的靶蛋白

2.2 應(yīng)用Gene Cards數(shù)據(jù)庫

以“novel coronavirus pneumonia”為關(guān)鍵詞，搜索新型冠狀肺炎的疾病靶點(diǎn)信息，共得到相關(guān)靶點(diǎn)259個(gè)，將疾病靶點(diǎn)與2.1步驟中獲得的藥物活性成分相對應(yīng)的蛋白取交集（如圖1），獲得治療靶點(diǎn)18個(gè)，包括：BAX、BCL2、CALM1、CASP3、CCL2、CXCL8、DPP4、F10、IL6、MAPK14、MCL1、NOS2、PPARG、PTGS1、PTGS2、RELA、TNF、TP53。

圖1 穿心蓮治療新冠肺炎的治療靶點(diǎn)

2.3 蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.3.1 藥物活性成分-治療靶點(diǎn)間的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖為進(jìn)一步研究治療靶點(diǎn)的生物學(xué)過程，并獲得藥物活性成分和治療靶點(diǎn)之間的相互作用，將治療靶點(diǎn)和其對應(yīng)的藥物活性成分導(dǎo)入Cytoscape-v 3.8.0，得到如圖2所示網(wǎng)絡(luò)圖。圖中，綠色代表治療靶點(diǎn)，紅色代表藥物活性成分，藍(lán)色代表穿心蓮制劑。其中，每個(gè)藥物成分及靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)圖中以節(jié)點(diǎn)表示，它們之間的相互作用以邊表示。圓形的面積越大，代表其degree值越高，degree代表網(wǎng)絡(luò)中與節(jié)點(diǎn)相連的節(jié)點(diǎn)數(shù)量，介數(shù)（betweenness）反映了相應(yīng)的節(jié)點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的作用和影響力。度和介數(shù)較高的節(jié)點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮樞紐的關(guān)鍵作用，可能是關(guān)鍵的靶蛋白或者重要成分[3]。治療靶點(diǎn)中有66.7%的靶點(diǎn)與2個(gè)以上藥物活性成分有相互作用，治療靶點(diǎn)的度值平均值為4.5，其中度值≥5的靶點(diǎn)有7個(gè)，分別是PTGS2、NOS2、PTGS1、DPP4、CALM1、PPARG、F10，見表3，提示這些可能是穿心蓮制劑治療新型冠狀肺炎的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

圖2 藥物活性成分-治療靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表3 度值較高的治療靶點(diǎn)

在藥物活性成分中，度值平均值為4.86，52%以上的成分可作用于3個(gè)及以上的靶點(diǎn)，其中度值≥6的有Wogonin（漢黃芩素）、Oroxylin a（千層紙黃素）、Moslosooflavone（蘇薺苧黃酮）、Deoxycamptothecine（脫氧喜樹堿）、andrographidine B_qt（穿心蓮內(nèi)酯B_qt）、andrographidine F_qt（穿心蓮內(nèi)酯B_qt）、Andrographin（穿心蓮黃酮）、Panicolin（二甲氧基黃酮）、Quercetin tetramethyl（3',4',5,7） ether （槲皮素）、Mono-O-methylwightin（5-羥基-7,8,2,3-四甲氧基黃酮），提示這些成分可能是穿心蓮制劑治療新型冠狀肺炎的主要成分。

2.3.2 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 將治療靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建靶點(diǎn)之間相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，如圖3，并將得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape-v3.8.0軟件，進(jìn)行可視化分析。蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖中，18個(gè)節(jié)點(diǎn)中有1個(gè)節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)游離，去掉該游離節(jié)點(diǎn)，剩余17個(gè)節(jié)點(diǎn)共得到86條相互作用，節(jié)點(diǎn)的平均度值為10.12，介數(shù)的平均值為0.026，其中均大于平均值的節(jié)點(diǎn)。提示在靶點(diǎn)之間交互作用較多的基因有TNF等九個(gè)基因，它們在治療中可能起主要作用。

圖3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO及KEGG功能富集分析

2.4.1 GO富集分析 將治療靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，設(shè)定物種為人源，對靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析。生物學(xué)過程中，起主要作用的包括細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)、炎癥應(yīng)答反應(yīng)、氨基酸反應(yīng)、對抗生素的應(yīng)答反應(yīng)、外源性凋亡信號(hào)通路、內(nèi)在凋亡信號(hào)通路對DNA損傷的響應(yīng)、對藥物的應(yīng)答、體液免疫應(yīng)答反應(yīng)等；細(xì)胞組分中，起主要作用的包括細(xì)胞質(zhì)、Bcl-2家族蛋白復(fù)合物、細(xì)胞核、線粒體等；分子功能中，起主要作用的包括蛋白酶、BH3域結(jié)合、同源及異源性蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合，蛋白磷酸酶結(jié)合、前列腺素內(nèi)過氧化物酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。應(yīng)用bioinformatics軟件做出柱狀圖，排名前十的條目見圖4，每組條目中P值排序由小至大。

圖4 穿心蓮制劑對新型冠狀肺炎治療靶點(diǎn)的GO富集分析

2.4.2 KEGG富集分析 利用metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG富集分析，設(shè)定物種為人源，結(jié)果共得到86條通路，其中排名前20的通路條目見圖5，按P值排序，得到主要的通路包括：癌癥通路（小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌），乙型肝炎通路、百日咳、神經(jīng)信號(hào)通路、P53信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡信號(hào)通路等，雌激素樣信號(hào)通路、A型流感通路、TNF信號(hào)通路。

圖5 穿心蓮制劑對新型冠狀肺炎治療靶點(diǎn)的KEGG富集分析

3 討論

新型冠狀病毒肺炎自發(fā)病以來，波及全球200多個(gè)國家和地區(qū)，世界人民生命安全和健康受到重大威脅，世界經(jīng)濟(jì)遭遇嚴(yán)重沖擊，其傳播速度之迅速、傳染人群之廣泛比預(yù)想更加嚴(yán)重，我們每一個(gè)國家都面臨著巨大的考驗(yàn)。SARS-CoV-2是導(dǎo)致COVID-19的病原體[4-6]，它是一種包膜病毒，屬于單鏈RNA病毒[7]，可以通過至少兩種不同的途徑進(jìn)入細(xì)胞，一種是由細(xì)胞表面的TMPRSS2誘導(dǎo)，另一種是由ACE2受體途徑介導(dǎo)[8]。宿主被感染后癥狀差異很大，可從無癥狀到多器官功能衰竭[9-12]。多種研究表明[13-15]，SARS-COV-2進(jìn)入細(xì)胞后可使病毒活躍復(fù)制，觸發(fā)細(xì)胞炎癥因子風(fēng)暴，如IL-6、TNF、IL-2、IL-7等多種炎癥因子共同作用，破壞肺泡II型上皮細(xì)胞，損傷肺組織并破壞氣血屏障，最終導(dǎo)致呼吸衰竭和多器官功能損害。

穿心蓮為一年生草本植物，味極苦，歸經(jīng)心、肺、腸、膀胱，用于中草藥制劑的原料主要是穿心蓮內(nèi)酯及其衍生物，臨床常用劑型包括口服固體制劑和注射劑?？诜腆w制劑多以穿心蓮內(nèi)酯為原料，劑型包括滴丸劑、片劑、膠囊劑等。注射劑的原料為穿心蓮內(nèi)酯衍生物，主要產(chǎn)品有喜炎平注射液、蓮必治注射液、穿琥寧注射液、炎琥寧注射液[16]。其中，喜炎平注射液在《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》中被推薦為重型新型冠狀病毒肺炎的治療藥物[17]。穿心蓮內(nèi)酯具有較強(qiáng)的抗細(xì)菌和抗病毒的作用，且無明顯的耐藥性，是抗生素最有效的替代藥物[18]，目前主要與抗生素聯(lián)用，廣泛應(yīng)用于治療感染性疾病包括支氣管炎、扁桃體炎、細(xì)菌性痢疾等。有研究證實(shí)，穿心蓮內(nèi)酯可抑制炎癥因子過度釋放[19]，使肺炎患者體內(nèi)的TNF-α、IL-6、IL-8水平下降[20]，減輕肺損傷。還可以通過改變的多種氧化還原酶的mRNA表達(dá)，對細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷起起到重要的保護(hù)作用[21]。

通過蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)研究得出，治療中可能起主要作用的有TNF等九個(gè)基因。其中PPARG是過氧化物酶體增殖激活受體，它屬于核受體超家族的配體依賴轉(zhuǎn)錄因子，具有多種生物學(xué)功能，尤其是對炎癥反應(yīng)的控制[22]。PPARG在如中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞中廣泛表達(dá)[23]，可通過調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的遷移和激活發(fā)揮強(qiáng)大的抗炎作用、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬作用、調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，如腫瘤壞死因子-TNF，IL-1，IL-6，IL-8和IL-10等[24]。MAPK14是一種負(fù)調(diào)控因子，在細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，它在血管損傷后可以被激活，在血管重塑過程中具有重要作用，MAPK14被激活后促炎細(xì)胞因子和趨化因子如IL6、IL8、CXCL1等明顯上升[25]，促進(jìn)細(xì)胞因子風(fēng)暴形成。

通過富集分析，認(rèn)為穿心蓮主要通過TNF信號(hào)通路、內(nèi)外源性細(xì)胞凋亡信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、甲型流感信號(hào)通路、肺癌信號(hào)通路等發(fā)揮抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗細(xì)胞凋亡的作用。腫瘤壞死因子TNF可以引發(fā)多種細(xì)胞反應(yīng)，如炎癥、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和凋亡啟動(dòng)[26]。NOD樣受體信號(hào)通路參與宿主損傷、免疫和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，NOD樣受體信號(hào)的重要成分NLRP3炎性小體是一種胞內(nèi)多蛋白復(fù)合物，激活后可導(dǎo)致大量的caspase-1前體被p10片段裂解為活化的caspase-1，進(jìn)而促進(jìn)下游促炎細(xì)胞因子如IL-1和IL-18的成熟和分泌，加重炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[27]。

通過本次網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，得出了穿心蓮主要的活性成分及作用靶點(diǎn)，穿心蓮制劑可能通過作用于上述通路及靶點(diǎn)，起到治療新型冠狀病毒肺炎的作用，但還需通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)；也可以通過這些靶點(diǎn)，嘗試開發(fā)新的藥物用于治療COVID-19。此外，還可以探索含有上述成分的藥物是否具有相同的治療作用，以達(dá)到舊藥新用的目的。