劉楓秀 劉言言 袁璧釵 邱楚佳 楊川

骨質(zhì)疏松癥是一種與年齡相關(guān)的骨骼疾病,主要是以單位體積骨量減少,導(dǎo)致骨脆性增加,從而易于發(fā)生骨折為特征。流行病學(xué)調(diào)查顯示,目前,全世界約有2 億人患骨質(zhì)疏松癥［1］,而我國在過去12 年中骨質(zhì)疏松癥的患病率明顯增加(2008 年以前患病率為14.94%,2012～2015 年期間患病率為27.96%),其中女性患病率明顯高于男性(25.41% VS 15.33%)［2］。因此,提高絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥防治的水平意義重大。研究表明,絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥及其骨折的發(fā)生是遺傳因素和非遺傳因素相互作用的結(jié)果,雙生子及家系研究表明,骨密度的變異50%～85%是由遺傳所決定的［3］。隨著遺傳變異逐漸認(rèn)識其在骨質(zhì)疏松癥發(fā)病過程的重要性,絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的遺傳學(xué)已經(jīng)成為骨生物學(xué)研究最為活躍的研究領(lǐng)域之一。厚皮性骨膜病是一種以皮膚增厚、回狀顱皮、骨膜肥厚、關(guān)節(jié)腫脹、杵狀指(趾)為臨床特征的遺傳性骨代謝疾病,HPGD 基因突變被證實(shí)其通過改變下游因子前列腺素E2(PGE2)濃度起而成為該病的致病原因［4］,而PGE2也是骨質(zhì)疏松癥發(fā)病過程中重要的調(diào)節(jié)因子,而關(guān)于HPGD 基因表達(dá)與骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系,目前尚無相關(guān)報(bào)道,本研究通過測定實(shí)驗(yàn)組及對照組HPGD 基因表達(dá)水平,探討HPGD 基因表達(dá)量與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集揭陽市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科 2019 年4 月～2020 年2 月住院的54 例絕經(jīng)5 年內(nèi)女性患者作為研究對象,經(jīng)DAX 檢測骨密度,將L1～2T 值≤-2.5 確診為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的患者作為實(shí)驗(yàn)組(20 例),L1～2T 值>-2.5 確診為非骨質(zhì)疏松癥患者作為對照組(34 例)。所有研究對象均為無血緣關(guān)系的漢族人群。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除嚴(yán)重肝腎功能不全、嚴(yán)重心腦血管疾病、惡性腫瘤、其他系統(tǒng)嚴(yán)重器質(zhì)性病變及服用影響骨代謝的藥物,排除其他繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集和生化指標(biāo)測定 所有患者為絕經(jīng)后5 年內(nèi)女性患者,記錄患者的年齡、身高、體重,計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)：體重(kg)/身高(m)2,記錄吸煙、飲酒情況。受檢者空腹8 h 以上,清晨采集靜脈血,用奧林巴斯AU400 全自動(dòng)生化儀檢測FBG、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

1.2.2 性激素6 項(xiàng)測定 清晨空腹抽取所有患者外周血2 ml,離心提取血清,采用放射免疫法測定E2、孕酮(P)、促黃體生成素(LH)、促卵泡刺激素(FSH)、雄激素(T)、泌乳素(PRL)。

1.2.3 骨代謝生化指標(biāo)及骨密度測定 采用全自動(dòng)生化分析儀測定所有患者的Ga、IP、ALP、PTH 等骨代謝生化指標(biāo)；應(yīng)用法國DMS 公司生產(chǎn)的雙能DAX 檢測患者腰椎前后位骨密度,自動(dòng)測出T 值,骨密度檢測人員為經(jīng)過專門培訓(xùn)的同一個(gè)技術(shù)人員。

1.2.4 HPGD 基因表達(dá)水平檢測

1.2.4.1 提取人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)取3 ml裝于乙二胺四乙酸(EDTA)管中的人外周全血,按順序加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS)等比例稀釋,混勻,稀釋后的人血(6 ml)沿管壁緩慢加入裝有淋巴細(xì)胞分離液(3 ml)的試管中,保持淋巴細(xì)胞分離液與人血界面明顯,離心(420 r,30 min),可見分為四層,血清與淋巴細(xì)胞分離液之間的不透明層,即為PBMC,移至新試管中,加入PBS(3 倍PBMC 體積),吹勻,離心(1000 r,5 min),棄上清液,加入2 ml 的紅細(xì)胞裂解液,吹勻,離心(1000 r,5 min),棄上清液,加入5 ml 的PBS,吹勻,離心(1000 r,5 min),棄上清液。

1.2.4.2 RT-qPCR 檢測HPGD 基因表達(dá)水平 按照RNAiso Plus 試劑說明書(TAKAR,貨號9109) 提取PBMC 總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(TAKARA 貨號RR036A),以Actin 作為內(nèi)參,RT-qPCR(型號Roche LightCycler 480 Ⅱ) 檢 測HPGD 基因表達(dá)水平,用2-ΔΔCt統(tǒng)計(jì)方法分析所有患者HPGD 基因表達(dá)水平。RT-qPCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min,95℃變性10 s,60℃延伸40 s,共40 個(gè)循環(huán)。引物設(shè)計(jì)后外送廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司進(jìn)行合成,序列見表1。

表1 PCR 引物序列

1.3 觀察指標(biāo) 比較兩組年齡、FPG、Ca、IP、ALP、PTH、E2、骨密度T 值及HPGD 基因表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 ()表示,采用t 檢驗(yàn)；RT-qPCR 分析時(shí),用2-ΔΔCt統(tǒng)計(jì)方法分析HPGD 基因相對表達(dá)量的差異。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組年齡、FPG、Ca、IP、ALP、PTH、E2及骨密度T 值比較 兩組年齡、FPG、Ca、IP、ALP、PTH、E2比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組骨密度T值明顯低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組年齡、FPG、Ca、IP、ALP、PTH、E2 及骨密度T 值比較()

表2 兩組年齡、FPG、Ca、IP、ALP、PTH、E2 及骨密度T 值比較()

注：與對照組比較,aP<0.05

2.2 兩組HPGD 基因表達(dá)量比較 實(shí)驗(yàn)組HPGD 基因表達(dá)量(1.079±1.190)明顯低于對照組的(2.349± 3.131),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。這表明絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者HPGD 基因表達(dá)顯著下調(diào),該基因在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病過程中可能起到某種調(diào)控作用。

圖1 兩組HPGD 基因表達(dá)水平比較

3 討論

2008 年,英國Uppal 等首次在厚皮性骨膜病家系中鑒定到HPGD 基因純合突變,并證實(shí)該基因突變是該病的致病原因［4］。HPGD 基因位于染色體4q34.1,長度為31kb,由7 個(gè)外顯子組成,并編碼催化酶15-羥基前列腺素脫氫酶(15-PGDH)［5］,該酶通過催化PGE2脫氫生成酮基前列腺素(PGE-M),從而促進(jìn)前列腺素分解代謝,降低PGE2濃度［6］。厚皮性骨膜病患者因HPGD基因突變,使編碼的15-PGDH 蛋白酶喪失正常功能,不能催化PGE2降解,體內(nèi)PGE2長期慢性增高,導(dǎo)致細(xì)胞因子相關(guān)的血管擴(kuò)張和組織重建,并促進(jìn)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性,產(chǎn)生一系列骨膜炎、肢端骨質(zhì)溶解和骨質(zhì)增生,最終出現(xiàn)厚皮性骨膜病的病理特 征［7］。

PGE2是一種重要的骨代謝調(diào)節(jié)因子,在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中均存在受體,不同的受體通過不同的信號通路對骨質(zhì)疏松起到雙重作用,一方面可促進(jìn)骨形成,另一方面可促進(jìn)骨吸收,其發(fā)揮的作用主要取決于存在的環(huán)境條件。本研究檢測了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者(實(shí)驗(yàn)組)和非骨質(zhì)疏松患者(對照組)的臨床生化、性激素、骨代謝、骨密度T 值等臨床指標(biāo),結(jié)果顯示,兩組年齡、FPG、Ca、IP、ALP、PTH、E2比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組骨密度T 值明顯低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組HPGD 基因表達(dá)量明顯低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。從而影響下游因子的PGE2的表達(dá)水平,而PGE2的生物活性與4 個(gè)G 蛋白藕連受體前列腺素E 受體1(EP1)、前列腺素E 受體2(EP2)、前列腺素E 受體3(EP3)、前列腺素E 受體4(EP4)有關(guān)［8］。PGE2通過與EP1結(jié)合,使Ca2+內(nèi)流,激活蛋白激酶C(PKC)通路,導(dǎo)致成骨細(xì)胞增殖［9］,另外可促進(jìn)大鼠原代成骨細(xì)胞纖維連接素的表達(dá)［10］,還可以通過調(diào)控縫隙連接蛋白的生成及轉(zhuǎn)運(yùn),使細(xì)胞之間的信息傳遞增加,進(jìn)而提高去分化脂肪細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的速度,加快了成骨細(xì)胞的成熟還有骨質(zhì)的重建［11］,從而起到抗骨質(zhì)疏松作用。另外,PGE2可通過激活多個(gè)信號通路誘導(dǎo)護(hù)骨素(OPG)同源配基核因子-κB 受體激活物配基(RANKL) mRNA 表達(dá),促進(jìn)破骨細(xì)胞生成［12］,抑制OPG mRNA 的表達(dá)［13］,引起 RANKL/OPG 的相對表達(dá)增加,促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化、成熟和破骨細(xì)胞骨吸收。體外研究表明,PGE2可通過EP2抑制由PTH 刺激的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨細(xì)胞分化,從而抑制PTH 的成骨作用,而使骨量降低［14］。

綜上所述,HPGD 的表達(dá)量與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥具有一定的相關(guān)性,HPGD 基因低表達(dá)可能使絕經(jīng)后的女性患者罹患骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險(xiǎn)升高。但本研究樣本量少,且缺乏對下游因子的進(jìn)一步研究,后續(xù)將進(jìn)一步探討HPGD 基因在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥調(diào)控過程中可能的信號通路。