牛海名，李建偉，陳妙蓮，劉定輝，吳 琳，凌葉盛，余顯冠，錢孝賢

（1.中山市人民醫(yī)院∕中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東中山 528400；2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東廣州 510630；3.中山大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所，廣東廣州 510630）

心血管病是我國城鄉(xiāng)居民死亡的首要原因，心血管病患者在今后的10年仍將快速增長［1］，這對人們的生命健康造成了極其嚴(yán)重的危害。從冠心病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的不斷研究中發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的障礙是冠心病發(fā)展的主要促動因素［2］；更進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的衰老是心腦血管事件發(fā)生的重要因素［3］。因此，改善內(nèi)皮細(xì)胞早期衰老對于動脈粥樣硬化的防治有著重要的意義［4］。繼一氧化碳（carbon monoxide，CO）和一氧化氮（nitric ox‐ide，NO）后，硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）是被發(fā)現(xiàn)的第3 個內(nèi)源性氣體信使［5］，能逆轉(zhuǎn)動脈粥樣硬化斑塊形成［6］。國內(nèi)外的研究已經(jīng)證實H2S可以對抗被誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的衰老，使受損的內(nèi)皮細(xì)胞功能有所恢復(fù)［7］，詳細(xì)的機(jī)制并未完全闡明。內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）可以促進(jìn)NO 的產(chǎn)生而發(fā)揮舒張血管的作用，其活性和表達(dá)均受上游相關(guān)蛋白通路的調(diào)節(jié)；脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-ki‐nase，PI3K）∕蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路可以介導(dǎo)eNOS 的磷酸化，從而影響NO 的含量［8］，發(fā)揮抗細(xì)胞衰老作用。在細(xì)胞的增殖、生長及功能等多方面，PI3K∕Akt ∕eNOS 信號通路均具有重要作用［9］。近期已經(jīng)有進(jìn)一步的研究表明高糖導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷可以通過PI3K∕Akt ∕eNOS 信號通路被保護(hù)和改善［10］。因此，在內(nèi)皮細(xì)胞的功能調(diào)控中，啟動PI3K∕Akt∕eNOS 信號通路從而發(fā)揮精準(zhǔn)靶向作用是至關(guān)重要的一個環(huán)節(jié)，有可能在人類動脈血管病變的防治工作中發(fā)揮重要的作用。本研究擬進(jìn)一步探討PI3K∕Akt∕eNOS 信號通路在外源性H2S 改善過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endotheli‐al cells，HUVEC）衰老中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

原代HUVEC來源于我院產(chǎn)科健康剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦的臍帶，實驗選用第2～4 代HUVEC。內(nèi)皮細(xì)胞的提取試劑包括：Ⅰ型膠原酶（GIBCO 公司）、0.05%EDTA 胰酶（GIBCO 公司）；內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)試劑包括：M199培養(yǎng)基（GIBCO 公司）、無血清培養(yǎng)基（GIBCO 公司）、胎牛血清（GIBCO 公司），以及從BD公司購買的內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑（endothelial cell growth supplement，ECGS）。硫氫化鈉（NaHS）購自于Sigma 公司，30 % H2O2購自于廣州化學(xué)試劑廠，衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶（senescence-associated βgalactosidase，SA-β-Gal）染色相關(guān)試劑。全蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒（BCA）和NO 測試盒分別購買自南京凱基生物有限公司、上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司、南京建成生物工程研究所。從美國的Millipore 公司采購PVDF 膜、ECL plus 超敏免疫印跡檢測試劑盒；凝膠電泳中所需要的甲叉雙丙烯酰胺和丙烯酰胺購買于美國Bio-Rad 公司；牛血清白蛋白（BSA）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、Tris 堿、過硫酸銨（AP）、Tween-20 均采購自美國MBCHEM公司。封閉液的主要成分（脫脂奶粉）為中國伊利產(chǎn)品。依照實驗所需要的蛋白抗體，從美國Cell Signaling Technology 公司購買的eNOS 兔抗、Akt 兔抗以及p-Akt 鼠抗；從美國Santa Cruz 公司購買的鼠抗Ⅰ型抗纖溶酶原激活物抑制劑（plasminogen activator inhibitor 1，PAI-1）；從美國Protein Tech Group公司購買的兔抗GAPDH；從武漢博士德公司購買的辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG，辣根酶標(biāo)記羊抗鼠IgG；實驗所需要的Marker 則購買自Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC 原代提取及培養(yǎng) 本研究經(jīng)中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院及中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，符合Helsinki 宣言中的原則，已取得患者知情同意。原代HUVEC分離提取及培養(yǎng)參照目前經(jīng)典方法［11］，方法如下：在無菌條件下用PBS 沖洗健康新生兒臍帶3 遍，然后用0.1 %Ⅰ型膠原酶消化15 min，收集膠原酶細(xì)胞混合液，300 ×g離心7 min 后棄上清，加完全培養(yǎng)基（20 %FBS，20 %SFM 和60 μg∕mL ECGS）混勻種于鋪有0.2 %明膠的T25 培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃，含有體積分?jǐn)?shù)5 %CO2的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)過一天的培養(yǎng)后，取出培養(yǎng)瓶在超凈工作臺內(nèi)用PBS沖洗去掉沒有貼壁生長的內(nèi)皮細(xì)胞和殘留未洗凈的紅細(xì)胞，然后繼續(xù)放置于5%CO2的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。近年來，國際上多采用血小板源內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31）來鑒定內(nèi)皮細(xì)胞，因此本實驗取第1代細(xì)胞，消化收集后交由我院中心實驗室對同一批所取HUVEC 檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物CD31；并在普通倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞融合至90% 以上時，在超凈工作臺內(nèi)用含有EDTA 的0.05 % 胰酶消化傳代至T25 培養(yǎng)瓶中，并繼續(xù)傳代培養(yǎng)。第2～4 代HUVEC將作為我們實驗所用的細(xì)胞。

1.2.2 衰老模型的建立及細(xì)胞分組建立H2O2誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老模型，細(xì)胞分為空白對照組（Control）和模型組（60 μmol∕L H2O2）［12］；當(dāng)細(xì)胞生長至約70%時，加入60 μmol∕L H2O2刺激1 h，后換成正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。通過SA-β-Gal 染色、PAI-1 表達(dá)鑒定模型是否成功。SA-β-Gal 染色參照既往方法進(jìn)行［13］，簡要過程如下：用PBS 輕輕清洗細(xì)胞2 次，0.5 % 戊二醛溶液固定5 min 后，每孔加入1 mL 染色工作液，用錫箔紙遮蓋后將細(xì)胞置于37°C 下孵育18 h。孵育結(jié)束后倒置顯微鏡下進(jìn)行計數(shù)和拍照，SA-β-Gal染色陽性率計算方法為：連續(xù)計數(shù)400 個細(xì)胞，計算出藍(lán)染細(xì)胞（即SA-β-Gal 染色陽性細(xì)胞）數(shù)目∕400 個細(xì)胞的百分比。PAI-1 蛋白表達(dá)檢測方法參見Western blot 部分；在探討硫化氫改善內(nèi)皮細(xì)胞早衰及其機(jī)制時分為：空白對照組（Control）、衰老模型組（60 μmol∕L H2O2）、50 μmol∕L NaHS 干預(yù)組、100 μmol∕L NaHS干預(yù)組和200 μmol∕L NaHS干預(yù)組。

1.2.3 Western Blot 蛋白提取液預(yù)先配置好，嚴(yán)格按照南京凱基生物有限公司全蛋白提取試劑盒說明書進(jìn)行操作，將磷酸酶抑制（7 μL）、蛋白酶抑制劑（0.7 μL）和PMSF（3.5 μL）加入到每700 μL 裂解液里。實驗所需每組細(xì)胞均使用PBS 清洗2 次，將已經(jīng)配制好的蛋白∥取液按照培養(yǎng)孔底面積而計算出相應(yīng)的量，逐個加入每組細(xì)胞培養(yǎng)孔底，并放置于冰面上進(jìn)行10 min 的裂解；到時間后，使用細(xì)胞刮逐個板孔刮下每組細(xì)胞，再用移液槍將每組細(xì)胞提取液吸至預(yù)先標(biāo)記好的預(yù)冷EP 管內(nèi)；將裝有各組細(xì)胞提取液的EP管繼續(xù)放置冰上于搖床上進(jìn)行15 min 的混勻裂解，結(jié)束后于4oC，14 000 ×g離心15 min；進(jìn)行完以上的提取操作后，應(yīng)用移液槍吸取每組管內(nèi)的上清液至新的分別標(biāo)記的EP管，使用BCA 法測定蛋白濃度，分裝保存于-80oC冰箱，作為我們實驗所用各組蛋白提取液備進(jìn)行下一步實驗。

每個泳道蛋白上樣總量為20 μg，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品蛋白，電轉(zhuǎn)移至偏聚二氟乙烯（PVDF）膜上；使用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入下列一抗：PAI-1 鼠抗（1：1 000）、eNOS 兔抗（1：1 000）、Akt 兔抗（1：1 000），以及p-Akt 鼠抗（1：2 000），GAPDH（1：10 000），并放置于4oC 冰箱搖床上過夜；第二天棄去一抗，用TBST（Tris 50 mmol∕L，NaCl 100 mmol∕L，pH7.5，含1 %Tween20）清洗3 次（每次5 min），然后分別加入二抗：辣根酶標(biāo)記羊抗鼠IgG（1：10 000）、辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG（1：10 000）；室溫孵育1 h 后棄去二抗，放置于1×TBST 搖床上清洗3 次；使用ECL 顯影，蛋白條帶使用Quantity One 軟件進(jìn)行分析。

1.2.4 細(xì)胞上清液NO含量測定 嚴(yán)格按照南京建成生物研究所NO試劑盒說明書進(jìn)行操作。簡要的過程如下：收集實驗中各組內(nèi)皮細(xì)胞上清液作為待測樣本；按照步驟加入樣本0.1 mL 及混合試劑0.4 mL（試劑一與試劑二1：1 混勻配制），37 ℃水浴60 min；加入試劑三0.2 mL、試劑四0.1 mL，充分旋渦混勻30 s，室溫靜置40 min，離心10 min；取各組上清液0.5 mL，均加入顯色劑0.6 mL 混勻，室溫靜置10 min，波長550 nm，光徑0.5 cm，測定各組吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0 分析軟件，定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示；只有兩組計量資料時，通過正態(tài)性檢驗確認(rèn)正態(tài)性和方差齊性后使用獨立樣本t檢驗；多組計量資料通過正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗確認(rèn)為正態(tài)分布且方差齊后，數(shù)據(jù)組間差異性比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），差異有統(tǒng)計學(xué)意義時采用LSD-t法進(jìn)行組間兩兩比較。P＜0.05可認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定與衰老模型的建立

在倒置顯微鏡下，從臍帶靜脈消化下來的HU‐VEC初為圓形，接種24 h后，細(xì)胞完全貼壁，早期細(xì)胞呈現(xiàn)多角形，胞漿豐富，核清晰，核分裂相多見，細(xì)胞融合后，呈典型的鋪路石樣排列（圖1A）；48～72 h 后原代細(xì)胞融合度90%左右，以1：2 或者1：3傳代。我院中心實驗室檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物CD31的結(jié)果顯示所取細(xì)胞的第一代細(xì)胞CD31 表達(dá)率98.99%，符合內(nèi)皮細(xì)胞特性（圖1B）。按照我們既往的研究成果，選擇60 μmol∕L H2O2作用于內(nèi)皮細(xì)胞1 h可以有效誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老而不出現(xiàn)明顯凋亡［14］。60 μmol∕L H2O2加入到生長至約70%的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行刺激，1 h 后換成正常培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h。通過SA-β-gal 衰老染色（圖2A、B），發(fā)現(xiàn)60 μmol∕L H2O2刺激組SA-β-gal 陽性率顯著增多（P＜0.001），兩組數(shù)據(jù)滿足方差齊性（F=5.374，P=0.081）；通過Western blot 實驗（圖2C、D），60 μmol∕L H2O2刺激組PAI-1 表達(dá)顯著增加（P＜0.001），兩組數(shù)據(jù)滿足方差齊性（F=4.000，P=0.116）；均通過t檢驗分析，與正常對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定Fig.1 The identification of HUVEC

圖2 H2O2預(yù)處理對細(xì)胞衰老的影響Fig.2 The effects of H2O2 pretreatment on cell senescence

2.2 NaHS對內(nèi)皮細(xì)胞衰老的影響

根據(jù)我們既往的分組、研究，用不同濃度的NaHS預(yù)處理細(xì)胞24 h后，再加入60 μmol∕L H2O2刺激細(xì)胞1 h，并繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集組細(xì)胞固定后進(jìn)行SA-β-gal 染色，以及各組蛋白進(jìn)行PAI-1 蛋白水平的測定。從圖3A、B 中可以看出，與對照組相比，60 μmol∕L H2O2誘導(dǎo)衰老模型組SA-β-gal 陽性率明顯增加（P＜0.001），而加入50 μmol∕L，100 μmol∕L 及200 μmol∕L NaHS 預(yù)孵育24 h 組細(xì)胞SA-β-gal陽性率明顯低于衰老模型組（P＜0.001），其改善程度具有濃度依賴性。同樣，在圖3C、D中，60 μmol∕L H2O2誘導(dǎo)衰老模型組PAI-1表達(dá)增加（P＜0.001），而加入不同濃度NaHS 預(yù)孵育組能減少PAI-1 蛋白水平表達(dá)（P＜0.001），提示NaHS 可改善內(nèi)皮細(xì)胞的衰老，其改善程度具有濃度依賴性。

圖3 NaHS預(yù)處理對各組細(xì)胞衰老的影響Fig.3 Effect of NaHS pretreatment on the senescence of HUVEC

2.3 NaHS預(yù)處理對PI3K/Akt/eNOS通路的影響

首先，我們對各組細(xì)胞中的p-Akt 蛋白進(jìn)行檢測。從圖4A、B 看出，與對照組相比，60 μmol∕L H2O2誘導(dǎo)衰老模型組p-Akt 蛋白表達(dá)增多（P＜0.01），與衰老模型組相比，50 μmol∕L，100 μmol∕L及200 μmol∕LNaHS 預(yù)孵育24 h 組p-Akt 蛋白表達(dá)進(jìn)一步增多（P＜0.01），其增加程度具有NaHS濃度依賴性；而各組Akt蛋白表達(dá)無明顯差別。

然后我們進(jìn)行了各組細(xì)胞eNOS 蛋白的檢測。60 μmol∕L H2O2誘導(dǎo)衰老模型組eNOS 蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.001），與衰老模型組相比，100 μmol∕L 及200 μmol∕L NaHS 預(yù)孵育24 h 組eNOS 蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.001），其增加程度具有NaHS 濃度依賴性（圖4C、D）。提示NaHS 可提高老年內(nèi)皮細(xì)胞的eNOS 蛋白活性，進(jìn)而我們推測NaHS 可能通過激活PI3K∕Akt∕eNOS 通路來對抗衰老。

圖4 NaHS預(yù)處理對各組細(xì)胞PI3K/Akt/eNOS通路的影響Fig.4 Effect of NaHS pretreatment on PI3K/Akt/eNOS signaling pathway in HUVEC

2.4 NaHS預(yù)處理對衰老內(nèi)皮細(xì)胞NO含量的影響

為了更加完整的證明和闡述PI3K∕Akt∕eNOS信號通路可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞中NO的產(chǎn)生從而發(fā)揮舒張血管的作用，我們對每組細(xì)胞上清液中的NO 含量也進(jìn)行了相關(guān)檢測。與對照組相比，60 μmol∕L H2O2誘導(dǎo)衰老模型組NO 含量顯著減少（P＜0.001）。而 加 入50 μmol∕L，100 μmol∕L 及200 μmol∕L NaHS 預(yù)孵育24 h 的3 組NO 含量較早衰模型組升高（P＜0.01），并且對NO含量的影響具有濃度依賴性（圖5）。

圖5 NaHS預(yù)處理對各組細(xì)胞內(nèi)NO含量的影響Fig.5 Effect of NaHS pretreatment on NO concentration in HUVEC

3 討論

我們在本研究中發(fā)現(xiàn)，HUVEC 衰老模型組中的PAI-1 蛋白表達(dá)和SA-β-gal 陽性細(xì)胞率均可被外源性H2S 減少，即外源性H2S 成功的延緩了HU‐VEC的老化過程。NaHS的預(yù)處理可以改善H2O2誘導(dǎo)的HUVEC 的衰老，可能是通過激活PI3K∕Akt∕eNOS通路來發(fā)揮其影響衰老的HUVEC的作用。

H2S 是人體內(nèi)的第3 種氣體信號分子，在心血管系統(tǒng)的功能保護(hù)中發(fā)揮了重要的作用［14］，有研究發(fā)現(xiàn)，硫化氫可以延緩動脈粥樣硬化斑塊的形成，及減小斑塊，動脈粥樣硬化形成的其中一個重要原因就是體內(nèi)H2S 水平的下降［15］。我們課題組既往研究也證實外源性H2S 可以通過抗氧化應(yīng)激［12］、調(diào)控Sirt1∕eNOS信號通路［16］來改善內(nèi)皮細(xì)胞衰老。

另一種氣體信號分子NO 主要由內(nèi)eNOS 在內(nèi)皮細(xì)胞中產(chǎn)生［17］，可以減少細(xì)胞凋亡、抑制白細(xì)胞和血小板對血管壁的粘附、舒張血管等。NO 可以單獨或者與H2S 協(xié)同舒張血管平滑肌；血管舒張效應(yīng)在單獨應(yīng)用H2S 的情況下很微弱，而其舒張效應(yīng)在有NO存在的情況下可以增加13倍［18］。

PI3K 是一種重要的細(xì)胞脂質(zhì)激酶，它通過磷酸化磷脂酰肌醇將磷脂酰肌醇-4，5 二磷酸鹽轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3，4，5 三磷酸鹽，后者作為細(xì)胞內(nèi)重要的二級信使，將Akt 招募到質(zhì)膜上并使其發(fā)生磷酸化。Akt 在PI3K∕Akt 信號通路中處于中心環(huán)節(jié)，可以被上游很多種信號分子激活而被磷酸化，同樣，磷酸化的Akt 則可進(jìn)一步調(diào)節(jié)下游多種效應(yīng)分子的活化、表達(dá)等狀態(tài)。磷酸化激活的Akt 可通過提高凋亡調(diào)控蛋白的表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡［19］，也可以通過抑制磷酸酶和張力蛋白同源物來減輕血管平滑肌細(xì)胞存活的抑制，從而保護(hù)心肌細(xì)胞免受傷害［20］。eNOS 同樣是Akt 下游重要的一種底物，可以被Akt 直接磷酸化其ser177 位點而被激活［21］。磷酸化Akt 調(diào)節(jié)可以通過PI3K∕Akt∕eNOS 信號通路增強(qiáng)eNOS 釋放NO，發(fā)揮舒張血管的作用［22］，小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙也可以通過PI3K∕Akt∕eNOS信號通路得到緩解［23］。目前，國內(nèi)外關(guān)于H2S與Akt 磷酸化相互關(guān)系的研究也逐漸增多，例如H2S 可以抑制Akt 過度磷酸化從而延緩內(nèi)皮細(xì)胞的衰老［24-25］，而在另外的研究中發(fā)現(xiàn)H2S 促進(jìn)存活大鼠模型中的新生血管的形成和生長，依賴于血管內(nèi)皮細(xì)胞中PI3K∕Akt 通道的激活。我們本次的研究也進(jìn)一步豐富了H2S 改善內(nèi)皮細(xì)胞衰老，尤其是使用H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞早期衰老的機(jī)制。

在我們的實驗研究中，衰老模型的p-Akt 表達(dá)增多，說明Akt 能影響衰老的進(jìn)程，eNOS 蛋白表達(dá)減少，NO含量減少。而與衰老模型組相比，加入不同濃度硫氫化鈉預(yù)保護(hù)組p-Akt 蛋白表達(dá)進(jìn)一步增加，eNOS 蛋白表達(dá)增加，同時，NO 含量也呈現(xiàn)出與H2S 濃度梯度相關(guān)的增加。這樣的結(jié)果，我們推測可能是通過上調(diào)PI3K∕Akt 路徑，增加eNOS 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而出現(xiàn)細(xì)胞NO含量的增加，從而發(fā)揮抗內(nèi)皮細(xì)胞衰老的作用。本研究經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)NaHS對內(nèi)皮細(xì)胞衰老的改善作用可能與激活PI3K∕Akt∕eNOS 信號通路有關(guān)，若要確定該信號通路在NaHS改善衰老中的作用，還需要進(jìn)一步使用信號通路特異性抑制劑進(jìn)行驗證。綜上所述，本次研究進(jìn)一步證實了H2S 防治內(nèi)皮細(xì)胞衰老的可行性，以及可能作用機(jī)制；也為內(nèi)皮細(xì)胞衰老和動脈粥樣硬化的臨床干預(yù)都提供了新的思路和靶點。