江錦趙，鄒立秋，張豪，鐘文新，程琳，沈新平*，楊洋

慢性肝病發(fā)展為肝纖維化(liver f ibrosis，LF)[1]，肝損傷促纖維化細(xì)胞包括肝星狀細(xì)胞等激活與增殖，進(jìn)而激活肌纖維母細(xì)胞，分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)(ext racel l ul ar mat r ix，ECM)沉積于細(xì)胞外間隙，若不治療，最終發(fā)生肝硬化及并發(fā)癥[2-4]。因此檢測肝纖維化發(fā)展，早期診斷尤為重要。肝臟穿刺活檢雖然為診斷參考標(biāo)準(zhǔn)，但出血、取樣誤差等諸多缺點卻限制了臨床應(yīng)用[5-6]。近年，磁共振動態(tài)增強(qiáng)掃描技術(shù)(dynamic cont r ast-enhanced magnet ic resonance imaging，DCE-MRI)廣泛應(yīng)用于臨床檢測肝癌，許多研究者將其應(yīng)用于評估LF分期[7-8]，而釓塞酸二鈉(Gd-EOB-DTPA)作為肝臟特異性MR對比劑，在掃描早期能反映慢性肝病的變化，肝膽期(注射后20 min)可以反映肝臟細(xì)胞的損傷程度[1，9]。本文旨在討論Gd-EOB-DTPA DCE-MRI定量評估兔肝纖維化早期分期的血流動力學(xué)改變的定量研究。

1 材料與方法

本實驗研究經(jīng)本單位動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)(20170218)。

1.1 實驗動物

本實驗由廣東醫(yī)學(xué)動物實驗中心提供實驗兔及病理學(xué)檢測。200只純種、健康新西蘭大白兔，雄性、6月齡、體質(zhì)量2.0 ～2.5 kg，單籠飼養(yǎng)(飼養(yǎng)溫度16～28℃、環(huán)境濕度40%～70%、晝夜間斷照明10 h∶14 h)。

1.2 建立動物模型

將100%四氯化碳(CC14液)與橄欖油(體積比1∶1)均勻混合，配成50%CC14油溶液。LF組兔每周經(jīng)頸背部皮下注射50%CC14油溶液2次，第1～3周劑量約0.1 mL/kg，第4～6周劑量約0.2 mL/kg，第7～10周劑量約0.3 mL/kg。

1.3 檢查方法

采用荷蘭Phil ips Achieva 3.0 T MR掃描儀，體部線圈。掃描前實驗兔禁食12 h，肌肉注射甲苯噻嗪(0.1 mL/kg)行肌肉內(nèi)注射，10 min后經(jīng)耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉溶液(0.1 mL/kg)，將實驗兔置于仰臥位下，腹帶固定減輕呼吸運動。第4、5、6、15周末分別隨機(jī)選取LF組40只及對照組10只行MR肝臟軸位掃描，包括：(1)軸位T1WI(FSE)：TR/TE 185/3.3 ms，F(xiàn)OV 160 mm×140 mm，翻轉(zhuǎn)角15°；(2)軸位DCE-MRI(3D快速梯度回波序列)：TR/TE 126/13 ms，F(xiàn)OV 160 mm×140 mm，翻轉(zhuǎn)角15°；以上序列層厚4 mm，層間距0.4 mm。DCE-MRI先行兩期增強(qiáng)前連續(xù)脂肪抑制掃描作為每個像素的T1弛豫時間的基線，于第3期末經(jīng)耳緣靜脈注射對比劑(Gd-EOB-DTPA 0.0 25 mmol/kg)，3 s內(nèi)注射完成，再用生理鹽水(2 mL)沖管，連續(xù)掃描60期，每期采集16層，總時長10 min 27 s。肝膽期在注射后20 min進(jìn)行掃描，掃描后耳緣靜脈注射空氣20 mL處死取肝組織進(jìn)行病理學(xué)肝纖維化分期。

1.4 圖像分析

雙盲前提下，由兩名具備5年以上腹部影像診斷經(jīng)驗的放射診斷醫(yī)師進(jìn)行定量分析。將掃描所得Gd-EOB-DTPA DCE-MRI圖像傳輸至DCE-MRI分析軟件，采用配準(zhǔn)技術(shù)校正，應(yīng)用雙輸入-雙室Extended Tof ts藥物代謝動力學(xué)模型[10]，動脈輸入函數(shù)選取腹主動脈、靜脈輸入函數(shù)選取門靜脈主干進(jìn)行勾畫ROI測量，計算生成對比劑時間-信號強(qiáng)度曲線，擬合獲得各定量參數(shù)偽彩圖；避開偽影，勾畫3個ROI(15～20 mm2)，并計算平均值，包括容積轉(zhuǎn)運常數(shù)(vol ume t r ansf er constant，Ktrans)、返流速率常數(shù)(ref l ux rate constant，Kep)、血管外細(xì)胞外間隙容積分?jǐn)?shù)(vol ume f raction of extravascul ar extracel l ul ar space，Ve)、血漿容積分?jǐn)?shù)(vol ume f raction of pl asma，Vp)。

1.5 病理學(xué)檢查

掃描后采用空氣栓塞法處死所有實驗兔，取兔肝臟并放入10%甲醛固定后制石蠟切片，行HE、Masson三色染色，采用Scheuer評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分期[11]，分為5期：F0：無纖維化；F1：門靜脈匯管區(qū)擴(kuò)大，局限竇周、小葉內(nèi)纖維化；F2：匯管區(qū)周圍纖維化或者少量纖維間隔形成，小葉結(jié)構(gòu)保留；F3：大量纖維間隔、小葉結(jié)構(gòu)紊亂，無肝硬化；F4：肝硬化。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0 及MedCal c 18.2 .1 軟件行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)值用±s表示。Kol mogor ov-Smirnov檢驗所有計量資料是否符合正態(tài)分布。使用單因素方差分析(one-way anal ysis of var iance，ANOVA)比較各LF分期間Ktrans、Kep、Ve、Vp的差異，組間兩兩比較采用Dunnet t’s T3法。采用Spear man相關(guān)性分析各定量參數(shù)與LF分期之間的相關(guān)性。應(yīng)用ROC曲線研究各定量參數(shù)的診斷效能，包括AUC、最佳截斷值、敏感度、特異度、Youden指數(shù)和P值，采用DeLong進(jìn)行各定量參數(shù)AUC的兩兩比較。P＜0.0 5為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)結(jié)果

剔除死亡、圖像質(zhì)量差的實驗兔，余150只兔納入本研究，包括F0期32只、F1期32只、F2期35只、F3期30只、F4期21只(圖1)。

2.2 各定量參數(shù)分析

采用Kol mogor ov-Smir nov檢驗，Ktrans、Kep、Ve、Vp均不呈正態(tài)分布。各定量參數(shù)分布用±s表示，見表1，后處理圖像見圖2。

表1 不同肝纖維化分期兔肝臟Ktrans、Kep、Ve、Vp結(jié)果(±s)Tab.1 Summary values of DCE-MRIparameters in different LFstages(±s)

注：兩兩比較，Ktrans：在F0與F2、F3、F4組間，F(xiàn)1與F2、F3、F4組間，F(xiàn)2與F4組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0 5)；Kep：在F0與F2、F3、F4組間，F(xiàn)1與F2、F3、F4組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0 5)；Vp：在F1與F0、F2、F3、F4組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0 5)；Ve：各組間Ve差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.0 5)。

ANOVA分析：經(jīng)Levene方差齊性檢驗，Kep、Vp方差齊(P＞0.0 5)，Kt rans、Ve方差不齊(P＜0.0 5)，因此Kep、Vp采用ANOVA分析。Kep在F0與F2、F3、F4組間，F(xiàn)1與F2、F3、F4組間兩兩比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0 5)；Vp在F1與F0、F2、F3、F4組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0 5)。Ktrans、Ve進(jìn)行Wel ch方差分析，Ktrans在F0與F2、F3、F4組間，F(xiàn)1與F2、F3、F4組間，F(xiàn)2與F4組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0 5)；而各組間Ve差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.0 5)。各定量參數(shù)值的F值與P值見表1。

2.3 Spear man相關(guān)性分析

Ktrans與LF分期呈正相關(guān)(r=0.7 30，P＜0.0 001)；Kep與LF分期呈負(fù)相關(guān)(r=-0.6 17，P＜0.0 001)；而Ve、Vp與LF分期相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.0 5)。相關(guān)關(guān)系見圖3。

圖3 Ktrans、Kep、Ve、Vp與肝纖維化分期的相關(guān)性曲線。A：Ktrans與肝纖維化分期呈正相關(guān)(r=0.7 30，P＜0.0 001)；B：Kep與肝纖維化分期呈負(fù)相關(guān)(r=-0.6 17，P＜0.0 001)；C：Ve與肝纖維化分期間無相關(guān)性(r=-0.0 74，P=0.3 67)；D：Vp與肝纖維化分期間無相關(guān)性(r=-0.0 78，P=0.3 42)Fig.3 Correlational trendline graph of Ktrans,Kep,Ve,and Vp values with liver fibrosis stage F0 to F4.A:Positive correlation between liver fibrosis stage and Ktrans values(r=0.7 30,P＜0.0 001);B:Negative correlation was identified between Kep values and liver fibrosis stage(r=-0.6 17,P＜0.0 001);C:No correlation between liver fibrosis stage and Ve values(r=-0.0 74,P=0.3 67);D:No correlation between liver fibrosis stage and Vp values(r=-0.0 78,P=0.3 42).

2.4 ROC曲線分析診斷效能

ROC分析顯示Ktrans診斷效能最高，在鑒別正常肝臟與LF(F0 vs.F1～F4)、診斷早期LF(F0 vs.F1～F2)、診斷晚期LF(F0 vs.F3～F4)、鑒別早期LF與晚期LF(F1～F2 vs.F3～F4)的AUC分別為0.8 97、0.8 63、0.9 42、0.8 09，稍優(yōu)于Kep(AUC分別為0.8 20、0.7 87、0.8 64、0.7 68)，Vp在鑒別各組的診斷效能較低(AUC分別為0.6 70、0.7 40、0.5 78、0.7 04)，其中在診斷晚期LF差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.0 5)，而Ve鑒別各組LF的診斷效能差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.0 5)。各定量參數(shù)值對LF分期的診斷效能見表2，ROC曲線兩兩比較(DeLong法)的Z值、P值分布見表3，相應(yīng)ROC曲線見圖4。

表2 比較Ktrans、Kep、Ve、Vp在肝纖維化分期的診斷效能Tab.2 ROCcurve analysis of DCE-MRIparameters in different LFstages

表3 ROC曲線兩兩比較(DeLong法)Ktrans、Kep、Ve、Vp值在診斷肝纖維化分期分期的Z值、P值分布Tab.3 Comparison of ROCs(DeLong)result in the distribution of Z value and P value of DCE-MRIparameters in different LFstages

圖4 Ktrans、Kep、Ve、Vp在鑒別正常肝臟與肝纖維化(F0 vs.F1～F4)(A)、診斷早期肝纖維化(F0 vs.F1～F2)(B)、診斷晚期肝纖維化(F0 vs.F3～F4)(C)、鑒別早期肝纖維化與晚期肝纖維化(F1～F2 vs.F3～F4)(D)的ROC曲線Fig.4 ROC curve of Ktrans,Kep,Ve,and Vp in identifying LF stage between F0 and F1—F4(A),F0 and F1—F2(B),F0 and F3—F4(C),and F1—F2 and F3—F4(D),respectively.

3 討論

Gd-EOB-DTPA是肝細(xì)胞特異性MRI對比劑，在肝細(xì)胞內(nèi)聚集，10 min達(dá)峰值，50%經(jīng)膽道排泄；肝細(xì)胞受損，它的攝入和膽道排泄降低文獻(xiàn)報道慢性肝病以肝損傷后炎癥后肝臟血管形成與肝纖維化密切相關(guān)，炎癥和低氧、肝纖維化激發(fā)血管生成的主要誘導(dǎo)因素[12-14]。肝臟血管生成比較復(fù)雜，因肝實質(zhì)具有兩類不同微血管結(jié)構(gòu)，內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、遷移和作用對血管生成重要的作用，肝纖維化也不例外，阻止血管生成將成為治療肝纖維化的一種手段[15-17]。采用Gd-EOB-DTPA DCE-MRI評估肝內(nèi)血管形成和肝纖維化分期的相關(guān)性及肝膽期肝細(xì)胞的損傷程度，關(guān)于肝膽期肝細(xì)胞的損傷程度與肝纖維化的相關(guān)關(guān)系將在后續(xù)研究中論述。

目前研究多應(yīng)用基于時間-信號強(qiáng)度曲線的DCE-MRI半定量分析，多數(shù)研究采用Gd-DTPA進(jìn)行DCE-MRI成像；本研究采用Gd-EOB-DTPA DCE-MRI進(jìn)行定量研究肝纖維化，提取定量灌注參數(shù)Ktrans、Kep、Ve、Vp評估LF分期。Ktrans主要反映LF對比劑從血漿滲透至EES，反映內(nèi)皮細(xì)胞的激活增加血管滲透性增加使發(fā)生大量ECM沉積于細(xì)胞外間隙與竇周間隙，肝竇毛細(xì)血管化，與EES間物質(zhì)交換阻力增加[1-3]，理論上Ktrans隨LF進(jìn)展而降低。而本研究結(jié)果顯示Ktrans與LF分期呈高度正相關(guān)(r=0.7 30，P＜0.0 001)，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞不連續(xù)，Gd-EOB-DTPA可穿透肝竇內(nèi)皮細(xì)胞膜進(jìn)行轉(zhuǎn)運，肝纖維化后肝竇毛細(xì)血管化后造成肝竇壓力增高，門靜脈壓力增高、血流減緩，局部肝動脈血流灌注分?jǐn)?shù)代償性增高或可加速Ktrans轉(zhuǎn)運，并且EOB基團(tuán)能轉(zhuǎn)運至肝細(xì)胞內(nèi)等因素使Ktrans升高，而Liu等[18]、Li等[19]、Zhang等[20]、Ji等[21]研究兔CC14LF模型結(jié)果也顯示Ktrans與LF分期呈正相關(guān)。ROC分析顯示Ktrans能診斷早期LF(AUC=0.8 63)，診斷晚期LF(AUC=0.9 42)，能較好鑒別早期(F1～F2)LF與晚期LF。

Kep反映對比劑從EES返流至血漿的速率，肝竇毛細(xì)血管化、肝竇、門靜脈高壓，血流速度減緩，Kep理論上應(yīng)該下降(r=-0.6 17，P＜0.0 001)；Kep在診斷早期LF(AUC=0.7 87)、診斷晚期LF(AUC=0.8 64)、鑒別早期LF與晚期LF方面稍次于Ktrans；但是DeLong法結(jié)果顯示兩者差異并不顯著(Z＜1.9 6，P＞0.0 5)。

Ve指血管外細(xì)胞外間隙容積分?jǐn)?shù)，Vp反映細(xì)胞外血漿容積，本實驗結(jié)果顯示與LF分期間的無明顯相關(guān)性(P＞0.0 5)，LF病理EES可因膠原纖維沉積、局部炎癥、水腫等而增寬，隨LF進(jìn)展Ve先稍下降，晚期Ve升高；ECM早期沉積于EES或許不能造成Ve明顯上升，而肝竇毛細(xì)血管化、促纖維化細(xì)胞增殖、纖維增生破壞肝組織等原因也可能讓流入EES的對比劑減少，導(dǎo)致Ve下降。LF發(fā)生肝內(nèi)小血管阻塞，肝竇毛細(xì)血管化，門靜脈高壓，血管短路、肝動脈血流代償性增加，肝臟整體血流灌注下降等一系列血流動力學(xué)異常，或許是造成Vp無法準(zhǔn)確評估LF的重要因素[22]。

本研究的局限性：(1)兔CC14LF模型不同于人類慢性肝病，病理、血流動力學(xué)改變?nèi)杂袇^(qū)別；(2)肝臟鐵沉積、炎癥、脂肪沉積等對定量參數(shù)的影響未能完全除外；(3)Gd-EOB-DTPA DCE-MRI診斷LF的研究較少，藥物代謝動力學(xué)模型匹配性與各定量參數(shù)準(zhǔn)確性仍待考究。

總之，Gd-EOB-DTPA DCE-MRI通過獲得定量參數(shù)，尤其是Ktrans為無創(chuàng)性評估肝纖維化分期提供重要的診斷手段。

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無利益沖突。