李春萍，邱軼輝，夏厚胤，譚璐娜，許環(huán)宇，張瀚文，高景慧

(西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院， 陜西 楊陵 712100)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是畜禽最重要的蛋白質(zhì)飼草，主產(chǎn)區(qū)集中于我國西北干旱、半干旱地區(qū)，當(dāng)?shù)貧夂蚋稍?、降水較少。苜蓿特有的蒸騰系數(shù)高、水分散失快的生物學(xué)特性，是制約苜蓿主產(chǎn)區(qū)草產(chǎn)量提升的重要原因[1]。與國際育成品種相比，我國現(xiàn)有的苜蓿育成品種具有抗逆(寒冷、鹽堿和病蟲害)、耐牧及高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的特點(diǎn)，但品質(zhì)及產(chǎn)草量仍有大幅提升空間，尤其是西部主產(chǎn)區(qū)的苜蓿推廣品種[2]。突破高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)苜蓿品種的生物學(xué)限制，提高其生物抗旱能力，成為了我國西北主產(chǎn)區(qū)苜蓿品種改良的重要目標(biāo)。

近年來紫花苜蓿的常規(guī)育種技術(shù)多集中于選擇育種，主要為輪回選擇和混合選擇。雜交育種是作物育種中使用次數(shù)最多、育成品種最全、獲得成果最廣泛的育種技術(shù)。苜蓿品種的雜交選育，同樣取得了不錯(cuò)的效果[3]。研究表明，苜蓿通過品種間的雜交，可顯著提高其生產(chǎn)性能[4]；紫花苜蓿和黃花苜蓿間遠(yuǎn)緣雜交，其雜交后代的產(chǎn)草量顯著高于無性系[5]；Wagner和Velde[6]選育出的雜交苜蓿品種‘HybriForce-3400’，與品種‘55V50’(葉片含量45.0%)相比，葉片含量增加至48.8%；陳晶晶等[7]提出不同紫花苜蓿雜交，有望篩選出抗寒、優(yōu)質(zhì)的紫花苜蓿品種；烏云塔娜等[8]研究了苜蓿不育系雜交組合組配間的光合蒸騰特性，認(rèn)為苜蓿水分利用效率與雜種優(yōu)勢存在一定的關(guān)系。苜蓿是喜水植物，在保證產(chǎn)量的同時(shí)消耗大量水分，面對我國水資源短缺的狀況，如能解析苜蓿的生物節(jié)水機(jī)制及相關(guān)性狀，以此對高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)苜蓿品種進(jìn)行針對性抗旱篩選，可為高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)苜蓿品種的抗旱性改良提供新的科學(xué)思路及其選育方法。

本試驗(yàn)基于多父本雜交技術(shù)，對苜蓿的F1代進(jìn)行蒸騰特性、農(nóng)藝性狀觀測及抗旱性鑒定，并以品質(zhì)性狀和產(chǎn)量性狀為主要篩選條件，利用隸屬函數(shù)法，綜合評定紫花苜蓿多父本雜交后代低蒸騰下高產(chǎn)的可能性，探索減少苜蓿過度蒸騰達(dá)到生物節(jié)水的方法，以期為進(jìn)一步選育適宜我國西部地區(qū)推廣種植的高產(chǎn)抗旱苜蓿品種提供新的篩選方法和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地點(diǎn)為西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)科學(xué)系試驗(yàn)田(34°29′ N，108°07′ E)。該地屬東亞暖溫帶半濕潤半干旱氣候區(qū)，大陸性季風(fēng)型氣候特征；海拔514 m，年均溫12.9℃，年降雨量660 mm，年日照時(shí)數(shù)2 163.8 h，干燥度1～1.6，無霜期221 d；土壤pH為7.03，有機(jī)質(zhì)含量為0.82%，總氮含量為1.05 mg·g-1，總磷含量為1.28 mg·g-1。

1.2 試驗(yàn)材料

以試驗(yàn)地種植的紫花苜蓿多父本自由授粉，同一品種母本混合收獲的F1代種子為材料。根據(jù)前人的研究，選擇具有相關(guān)優(yōu)良性狀的苜蓿品種作為多父本雜交親本：‘武功’(Wugong)、‘三得利’(Sanditi)、‘賽迪10’(Sardi10)、‘隴南1號(hào)’(Longnan No.1)、‘WL168HQ’、‘WL343HQ’、‘WL656HQ’、‘WL712’、‘WL903’，種植圖見圖1?！甒L168HQ’、‘WL712’、‘WL903’具有抗旱性強(qiáng)的特點(diǎn)[9-10]；‘武功’、‘三得利’、‘賽迪10’、‘WL343HQ’、‘WL656HQ’、‘WL903’產(chǎn)草量高；‘WL656HQ’和‘WL903’還具有分枝多的特點(diǎn)[11-13]。

圖1 親本種植圖

實(shí)驗(yàn)室挑選健康飽滿的F1代種子，以15%的次氯酸鈉(NaClO)消毒10 min后用無菌水沖洗3遍。種子以1/2MS(Murashige and Skoog)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于25℃人工氣候培養(yǎng)箱中。待兩片子葉完全展開時(shí)選擇健康、生長一致的幼苗移入培養(yǎng)盆置于冬春季室外自然條件下繼續(xù)培養(yǎng)，選出12個(gè)株系作為本試驗(yàn)材料，其母本為抗旱性強(qiáng)、產(chǎn)草量高的‘WL903’和‘Sardi10’。初花期(盆栽)測定12個(gè)株系單株(每個(gè)株系各1株)的相關(guān)指標(biāo)，詳見表1。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1株高 用直尺(精度為0.1 cm)測量所選株系的絕對高度，每株自土表至最長枝條的頂芽。

1.3.2節(jié)間數(shù) 分別計(jì)量各株系單株植株全部枝條從基部到頂端的節(jié)間數(shù)。

1.3.3一級(jí)分枝數(shù) 參照魏臻武的方法[14-15]，從根頸處計(jì)量各株系單株的一級(jí)分枝數(shù)目。

1.3.4葉面積 分別對每株苜蓿植株隨機(jī)選取10片三出復(fù)葉，應(yīng)選取大小相近、發(fā)育良好、健康的葉片，測量每個(gè)小葉的長、寬。以三出復(fù)葉的3個(gè)小葉的長×寬的均值表示每片三出復(fù)葉的功能葉面積，每株測量10片三出復(fù)葉取平均值。

1.3.5葉片失水率與葉片含水量 根據(jù)曹宏等[16]的方法采集植株頂端發(fā)育良好的10片三出復(fù)葉，迅速在0.0001 g電子天平上稱重記錄初始重量，置于室溫下，測定采集后1 h，2 h，4 h，8 h的重量，最后置于烘箱65℃烘干24 h至恒重，稱量葉片干重。分別對每組葉片的各個(gè)測量時(shí)刻按照公式(1)計(jì)算當(dāng)時(shí)的葉片失水率。根據(jù)公式(2)計(jì)算葉片含水量。

葉片失水率=(初始重量—當(dāng)前重量)/初始重量×100%

(1)

葉片含水量=(初始重量—葉片干重)/初始重量×100%

(2)

1.3.6聚乙二醇-6000(polyethylene glycol-6000，PEG-6000)處理下的枝條失水率 每株植株取2根靠近頂端的長度約10 cm的枝條，分為處理組和對照組。取下的枝條應(yīng)發(fā)育良好，葉片生長整齊、健康，稱重記錄為m1后放置于1/2MS液體培養(yǎng)基中靜置3.5 h，使枝條適應(yīng)培養(yǎng)基滲透壓后快速擦干枝條上的水分稱重記錄為m2，將對照組重新放回1/2MS液體培養(yǎng)基中，將處理組中的枝條移至用1/2MS配置的15%PEG-6000溶液中處理3.5 h。擦干枝條上的水分后對處理組和對照組分別稱重記錄為m3，按照公式(3)計(jì)算枝條失水率，按照公式(4)計(jì)算相對失水率。

枝條失水率=(m2—m3)/m1×100%

(3)

式中：m2為枝條適應(yīng)后的重量；m3為枝條處理后的重量；m1為枝條剛離體時(shí)的重量。

相對失水率=處理組的枝條失水率—對照組的枝條失水率

(4)

1.3.7隸屬值 利用公式(5)計(jì)算各個(gè)指標(biāo)的隸屬值[17]。

R(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(5)

式中：Xi為指標(biāo)測定值，Xmin和Xmax為所有參試材料某一指標(biāo)的最小值和最大值。

如果為負(fù)相關(guān)，則按照公式(6)計(jì)算。

R(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(6)

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 2020和Excel 2016進(jìn)行分析，使用單因素ANOVA分析不同株系葉面積及失水性的差異，多重比較采用新復(fù)極差法，作圖用GraphPad Prism 8.0.2，利用隸屬函數(shù)分析法綜合評價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 F1代不同株系產(chǎn)量相關(guān)性狀的分析

苜蓿的分枝數(shù)和節(jié)間數(shù)在一定程度決定產(chǎn)草量，對苜蓿產(chǎn)量優(yōu)勢的形成具有重要影響[18]。由表2可知，在雜種F1各株系中，WL903-2#的分枝數(shù)(13個(gè))、節(jié)間數(shù)(67個(gè))最多，分枝數(shù)高于均值(6.8個(gè))90.2%，節(jié)間數(shù)高于均值(34.7個(gè))93.3%；Sardi10-4#分枝數(shù)(4個(gè))最少，WL903-3#節(jié)間數(shù)(16個(gè))最少。葉面積與苜蓿的產(chǎn)量和光合作用息息相關(guān)，影響苜蓿的適口性。表2表明，Sardi10-4#(428.4 mm2)和Sardi10-5#(489.5 mm2)的葉面積明顯高于另外9個(gè)株系(P<0.05)。株高與苜蓿的干草產(chǎn)量呈正相關(guān)[19]。盆栽條件下，Sardi10-5#的株高(53.5 cm)最高，其余各株系均明顯低于Sardi10-5#。

表2 F1代不同株系雜交種的株高、節(jié)間數(shù)、分枝數(shù)及葉面積分析

2.2 F1代不同株系蒸騰失水性分析

葉片含水量是評價(jià)植物抗旱性的重要指標(biāo)。在本次供試的材料中，各株系葉片含水量無顯著差異(圖2)，12個(gè)株系的葉片含水量均值為84.7%，WL903-1#—WL903-4#和Sardi10-4#葉片含水量低于均值，其余7個(gè)株系葉片含水量高于均值。含水量最高的株系是WL903-7#，為87.7%，WL903-3#(81.1%)含水量最低。

圖2 F1代不同株系雜交種的葉片含水量比較

植物水分散失的主要途徑是蒸騰作用，氣孔蒸騰是植物蒸騰作用的最主要方式。離體葉片水分的散失情況在很大程度上反映了整體植株的水分狀態(tài)，離體葉片失水率反映了其保水能力，即葉片組織抗脫水的能力，葉片失水率越低的植株，具有的抗旱能力就越強(qiáng)[20]。本試驗(yàn)中不同時(shí)間段下，12個(gè)株系葉片失水率如圖3所示，離體2 h時(shí)，株系WL903-3#和WL903-4#的失水率顯著低于其他株系(P<0.05)，離體8 h時(shí)株系WL903-5#和Sardi10-2#的失水率，則顯著高于其他株系(P<0.05)。

圖3 F1代不同株系葉片自然失水率比較分析

模擬干旱脅迫下，12個(gè)株系的枝條失水率都顯著高于對照組(圖4)。對照組除株系WL903-3#、WL903-4#和Sardi10-5#外，其余各株系失水率均為負(fù)值，說明大部分株系可適應(yīng)1/2MS環(huán)境并吸收其中的水分。15% PEG-6000處理下，Sardi10-4#枝條失水率(6.8%)最低，WL903-2#枝條失水率(13.4%)最高，且兩者之間差異極顯著(P<0.01)。

圖4 15% PEG-6000處理下F1代不同株系枝條失水率分析

在所有供試材料中(圖5)，WL903-4#枝條相對失水率(5.8%)最低，顯著低于其他11個(gè)株系(P<0.05)，與相對失水率最高的WL903-2#(17.5%)比較差異極顯著(P<0.01)。此外，Sardi10-4#和Sardi10-5#的相對失水率也較低，分別為8.2%，9.2%。

圖5 15% PEG-6000處理下F1代不同株系枝條相對失水率比較

2.3 雜交F1代株系的綜合評價(jià)篩選

按照公式(5)和公式(6)計(jì)算隸屬值，本試驗(yàn)主要根據(jù)產(chǎn)量性狀和抗性性狀進(jìn)行篩選，分別對株高、節(jié)間數(shù)、分枝數(shù)、葉面積、葉片失水率、枝條相對失水率6個(gè)指標(biāo)分別賦予0.2，0.1，0.1，0.2，0.2，0.2的權(quán)值，其結(jié)果如表3所示。其中性狀綜合評價(jià)最好的為Sardi10-5#株系。各株系性狀綜合表現(xiàn)順序?yàn)椋篠ardi10-5#>Sardi10-4#>WL903-4#>Sardi10-1#>WL903-2#>WL903-1#>WL903-6#>WL903-7#>Sardi10-2#>WL903-3#>Sardi10-3#>WL903-5#。

表3 12個(gè)雜交F1代株系農(nóng)藝性狀和抗性性狀綜合比較分析

3 討論

3.1 隸屬函數(shù)分析與多父本雜交早代的篩選

如果能在雜交早代精準(zhǔn)確定苜蓿性狀及其表型，則對品種后期篩選極其便利。種質(zhì)材料的綜合評價(jià)不僅需要適宜的評價(jià)指標(biāo)，還需要適宜的評價(jià)方法[21]。隸屬值函數(shù)分析可有效解決單一數(shù)據(jù)不能夠客觀、有效評價(jià)樣本綜合素質(zhì)的問題[22]，梁歡等[23]基于生理及生長的隸屬值函數(shù)分析，成功完成紫花苜蓿的抗旱性評價(jià)。針對本試驗(yàn)多父本雜交早代精準(zhǔn)篩選需求，試驗(yàn)根據(jù)生產(chǎn)上高產(chǎn)抗旱品種的選育目標(biāo)，對株高、節(jié)間數(shù)、分枝數(shù)、葉面積、失水率等6個(gè)生理及農(nóng)藝性狀分配合理的權(quán)值，通過隸屬值函數(shù)綜合性分析，達(dá)到了對紫花苜蓿多父本雜交早代低蒸騰精準(zhǔn)篩選的目的。

3.2 低蒸騰苜蓿產(chǎn)量性狀的抗旱性能篩選

紫花苜蓿作為我國西北地區(qū)最重要的一種栽培牧草，其產(chǎn)量與品質(zhì)廣泛影響到我國的畜牧業(yè)發(fā)展。隨著國內(nèi)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，為滿足畜牧業(yè)不斷增長的需求，我國對優(yōu)質(zhì)紫花苜蓿干草的需求也不斷增加。紫花苜蓿株高、分枝數(shù)、節(jié)間數(shù)、葉面積等農(nóng)藝性狀是衡量苜蓿產(chǎn)量的重要指標(biāo)。潘香逾等[24]研究表明，苜蓿鮮草產(chǎn)量和干草產(chǎn)量都與株高、根莖分枝數(shù)顯著正相關(guān)。苜蓿株高一定時(shí)，節(jié)間數(shù)越大產(chǎn)生的葉片越多，同孟昭儀[25]的結(jié)論“節(jié)間伸長造成葉量相對減少”一致。葉面積是衡量葉片光合作用制造有機(jī)物的能力的指標(biāo)，葉面積越大，越有利于提高苜蓿產(chǎn)量[26]。

曾澤堂等[27]比較我國西北地區(qū)廣泛種植的3個(gè)品種的紫花苜蓿，發(fā)現(xiàn)‘甘農(nóng)1號(hào)’紫花苜蓿的抗旱性較好，但產(chǎn)量性狀并不十分理想。張則宇等[28]對59份苜蓿種質(zhì)材料進(jìn)行評價(jià)篩選，綜合篩選出耐鹽性極強(qiáng)的材料‘美11’、‘中苜1號(hào)’、‘愛開夏’和‘中苜3號(hào)’。然而在我國共計(jì)77個(gè)登記品種中[2]，同時(shí)具有高產(chǎn)、抗旱特性的品種較少。在干旱條件下，紫花苜蓿通過改變自身葉面表皮蠟質(zhì)調(diào)控水分散失，通過提高根系長度和根系體積來獲取更多水分[29]。氣孔影響苜蓿蒸騰作用[30]，其開度和密度與苜蓿的抗旱能力有一定相關(guān)[31]。為此，Jin等[32]利用H2來調(diào)節(jié)苜蓿氣孔敏感性來提高苜蓿的抗旱能力，包愛科等[33]轉(zhuǎn)入旱生植物相關(guān)基因改變苜蓿氣孔運(yùn)動(dòng)與蒸騰作用，獲得了很好的抗旱苜蓿新品系，為利用現(xiàn)代生物技術(shù)，來提高苜?？购敌蕴峁┝怂悸?。紫花苜蓿高蒸騰特性，一直阻礙著我國苜蓿主產(chǎn)區(qū)的高產(chǎn)栽培。異花繁殖的紫花苜蓿進(jìn)行多父本雜交，可以使后代具有廣泛的遺傳基礎(chǔ)，極有可能從中篩選出低蒸騰、生物節(jié)水型苜?？购捣N質(zhì)。本試驗(yàn)通過自然控制蒸騰速率，結(jié)合自然失水和干旱脅迫(15% PEG-6000)鑒定，從苜蓿多父本雜交F1代中，篩選出低蒸騰并具有高產(chǎn)潛力的株系，說明可能可以利用植物的生物節(jié)水，篩選高產(chǎn)抗旱苜蓿品種。

4 結(jié)論

基于隸屬值函數(shù)分析，通過對多父本雜交F1代產(chǎn)量性狀和抗旱能力的綜合評價(jià)，初步篩選出低蒸騰、高產(chǎn)苜蓿株系Sardi10-5#和Sardi10-4#。