羅嗣昌，胥義

上海理工大學生物系統(tǒng)熱科學研究所，上海200093

前言

器官移植已成為治療器官疾病末期最有效的方法之一，每年都能拯救無數(shù)的患者。但當前供體器官不足的共性問題導致許多患者在等待供體過程中死亡［1］。另外，異體移植也可能因免疫系統(tǒng)的反應，致使移植患者需要長期服用免疫抑制劑［2］。隨著組織工程和再生醫(yī)學的發(fā)展，利用干細胞與器官支架再生器官可能能夠成為器官移植的來源［3‐4］。Meezan等［5］首先提出去污劑脫細胞的方法，并證實脫細胞后的細胞外基質(zhì)能保留超微結(jié)構(gòu)的不溶性成分。Ott等［6］通過在脫細胞大鼠腎臟接種干細胞構(gòu)建具有一定功能的腎臟，讓再生腎臟作為供體器官成為可能。脫細胞支架已將細胞及DNA 等物質(zhì)洗脫干凈，再生器官后能夠避免腎臟移植所引發(fā)的免疫抗原反應［7‐9］。

常用的脫細胞方法有洗脫劑洗脫法［10］、酶處理法［11］、凍融法［12］等。離子型洗脫劑SDS對細胞的洗脫效果較好，但同時會將腎臟內(nèi)的許多其他物質(zhì)一起洗脫，造成細胞外基質(zhì)各成分的損失［13］；非離子型洗脫劑Triton‐100對細胞外基質(zhì)的損傷較小，但細胞的洗脫效果不佳，很難將腎臟內(nèi)部的細胞成分完全洗脫干凈［14］。酶解法利用生物酶進行洗脫工藝處理，但研究表明，盡管酶解法能夠特異性去除細胞中DNA等成分，其單獨洗脫效果不好［15］。凍融法脫細胞利用凍融過程溶解細胞，再通過洗脫劑進行細胞的洗脫。凍融法能更有效地溶解組織和器官內(nèi)的細胞，凍融過程不會顯著增加組織中細胞外基質(zhì)蛋白的損失［12］。但有研究表明，凍融過程中出現(xiàn)的冰晶、產(chǎn)生的熱應力等都可能影響生物組織凍融后的結(jié)構(gòu)完整性［16‐17］。常采用添加低溫保護劑的方式來控制冰晶生長，并成功應用于多種生物材料低溫保存過程［18‐20］。滲透性低溫保護劑甘油和二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide,DMSO）是當前低溫保存中非常常見的低溫保護劑，能夠幫助一些生物材料在一定低溫條件下長時間保存；而海藻糖和麥芽糖作為非滲透性冷凍保護劑，越來越多的科學家將之用于低溫生物領(lǐng)域。但從文獻調(diào)研來看，不同保護劑輔助凍融脫細胞目前主要是在肝臟凍融法脫細胞方面取得較好效果［12］，而腎臟凍融法脫細胞方面鮮有應用和探討。

鑒于此，本研究初步探索幾種常用的保護劑及濃度對大鼠腎臟凍融法脫細胞支架的血管網(wǎng)絡完整性、DNA 殘留、細胞外基質(zhì)的保留和力學性能等影響，有望為后續(xù)腎臟凍融法脫細胞工藝優(yōu)化提供重要依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及試劑

成年雄性SD 大鼠48只（上海杰思捷實驗動物中心，清潔級），體質(zhì)量200 g 左右，按清潔級標準喂養(yǎng)。磷酸鹽溶液（PBS）（上海勵瑞生物科技有限公司），甘油（國藥集團化學試劑有限公司），DMSO（國藥集團化學試劑有限公司），海藻糖（國藥集團化學試劑有限公司），麥芽糖（國藥集團化學試劑有限公司），Triton X‐100（國藥集團化學試劑有限公司），Microfil造影劑（美國Flow Tech 公司），HE 染色盒（上海賽新生物科技有限公司），Masson 染色盒（上海賽新生物科技有限公司），Weigert 染色盒（上海賽新生物科技有限公司），彈性蛋白抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），三羥甲基氨基甲烷（Tris‐Hcl）（上海勵瑞生物科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 脫細胞方法實驗組分為未添加保護劑組、10%v/v甘油組（溶媒為雙蒸水）、10%v/v DMSO組（溶媒為培養(yǎng)基）、5%w/v麥芽糖組（溶媒為PBS）、5%w/v海藻糖組（溶媒為PBS），新鮮組未經(jīng)凍融法脫細胞過程處理。

利用麻醉劑將實驗大鼠深度麻醉后通過十字解剖法露出腹腔，并將左腎及主動靜脈裸露，進行主動脈插管，沖洗血液后灌注保護劑，將大鼠腎臟解剖離體，然后放置于‐20 ℃冰箱中進行冷凍。12 h 后在37 ℃溫水中進行水浴復溫，然后利用蠕動泵對腎臟用0.3%Triton X‐100 以0.4 mL/min 的流速灌注24 h，PBS灌注2 h。

1.2.2 實驗檢測分析方法（1）血管造影。利用造影劑對大鼠腎臟血管網(wǎng)絡進行固化，并利用CT 進行掃描，通過CT 三維重構(gòu)評估凍融法脫細胞腎臟血管網(wǎng)絡完整性及血管損傷情況。（2）染色切片及免疫組化。利用HE 染色切片檢測脫細胞支架DNA 殘留情況，利用Masson 染色切片和免疫組化檢測膠原及彈性蛋白保留情況［21］。（3）蛋白質(zhì)定量分析。利用考馬斯亮藍法定量檢測凍融法脫細胞腎臟支架蛋白質(zhì)的含量。（4）力學性能分析。利用動態(tài)力學分析儀（Dynamic Mechanical Analyzer,DMA）對大鼠凍融法脫細胞腎臟支架進行力學性能測試，通過壓力測試曲線得出樣本的彈性模量，從而評估凍融法脫細胞大鼠腎臟支架力學性能。

2 實驗結(jié)果

2.1 不同保護劑對血管網(wǎng)絡完整性的影響

血管網(wǎng)絡完整性檢測是利用造影劑灌注進入腎臟內(nèi)部血管，待造影劑固化后利用CT掃描觀察從而得到血管網(wǎng)絡圖，如圖1所示。圖1a為大鼠腎臟新鮮對照組血管網(wǎng)絡，從中可以清晰地看到正常大鼠腎臟完整的血管網(wǎng)絡；圖1b為不加載保護劑的凍融脫細胞腎臟支架血管網(wǎng)絡，可以發(fā)現(xiàn)其血管網(wǎng)絡損傷比較嚴重；加載10%甘油和5%麥芽糖這兩組的血管網(wǎng)絡也都損傷比較嚴重；但10%DMSO和5%海藻糖這兩組的血管網(wǎng)絡相對比較完整。其中甘油和DMSO為滲透性保護劑，麥芽糖和海藻糖為非滲透性保護劑。從血管造影結(jié)果來看，加載不同保護劑對凍融法脫細胞支架的血管網(wǎng)絡作用效果不同，不同類型保護劑均有可能對凍融法脫細胞支架血管網(wǎng)絡有保護劑作用。

圖1 加載不同保護劑大鼠腎臟凍融脫細胞支架的血管造影Fig.1 Angiography of the decellularization scaffolds of rat kidney obtained by freeze-thaw method with different cryoprotective agents

2.2 不同保護劑對細胞及DNA殘留的影響

HE 染色是一種能夠判定組織中是否還殘留DNA 及細胞核等物質(zhì)的重要手段。如圖2所示，新鮮組的HE 染色能看到完整的細胞核；未添加保護劑組藍色區(qū)域較多，但基本沒有成形的細胞核，說明凍融過程基本將細胞溶解了；10%甘油組視野內(nèi)基本看不到細胞核但仍存在部分藍色區(qū)域；10%DMSO 組也存在較多的藍色區(qū)域，說明支架內(nèi)還殘留比較多DNA 成分；5%麥芽糖組藍色區(qū)域比較明顯；5%海藻糖組視野內(nèi)基本看不到細胞核且藍色區(qū)域較少，說明脫細胞效果較好。從HE 染色切片來看，5%海藻糖DNA 殘留相對最少，即加載5%海藻糖組的脫細胞效果最好。從血管網(wǎng)絡來看，10%DMSO 和5%海藻糖的保存最為完整，但5%海藻糖脫細胞效果更好，這說明在加載不同保護劑的凍融法脫細胞方案中，血管網(wǎng)絡更加完整并不意味著脫細胞效果更好。在本研究中，5%海藻糖在血管網(wǎng)絡保存比較完整的同時其脫細胞效果也相對較好。

圖2 大鼠腎臟凍融脫細胞前后的HE染色（×100）Fig.2 HE staining of rat kidneys before and after freeze-thaw decellularization (×100)

2.3 不同保護劑對細胞外基質(zhì)的影響

Masson染色是檢測膠原纖維含量的一個重要方法。其中膠原是細胞外基質(zhì)的重要組成部分。圖3所示為新鮮對照組和不同實驗組的Masson染色切片結(jié)果。將新鮮對照組和不同實驗組進行對比可以發(fā)現(xiàn)，在不加載保護劑和加載不同保護劑的條件下，Masson染色的藍色著色區(qū)域大小基本相同。凍融法脫細胞的凍融過程對細胞外基質(zhì)成分的損傷是有限的，即使多次凍融也不會增加其損傷［12］。非離子型洗脫劑Triton‐100的洗脫過程對細胞外基質(zhì)中膠原含量的損傷也是非常小的。所以凍融法脫細胞能比較完好地保留大鼠腎臟的膠原，加載保護劑與否，凍融法脫細胞也不會造成膠原含量的損傷。

圖3 大鼠腎臟凍融脫細胞前后的Masson染色（×100）Fig.3 Masson staining of rat kidneys before and after freeze-thaw decellularization (×100)

免疫組化能夠?qū)μ禺愋缘鞍走M行著色，從而檢測特異性蛋白的含量。本實驗利用彈性蛋白抗體對大鼠腎臟脫細胞支架進行彈性蛋白免疫組化染色。彈性蛋白是維持脫細胞支架正常形態(tài)的重要成分，在后續(xù)的再細胞化再生器官中起著非常重要的作用。如圖4所示，通過對新鮮對照組和不同實驗組結(jié)果觀察可以發(fā)現(xiàn)，加載不同保護劑的彈性蛋白染色區(qū)域大小基本相同。這與Masson切片染色結(jié)果是相同的，說明凍融法脫細胞的凍融過程對彈性蛋白的損傷也是有限的。凍融法脫細胞對彈性蛋白的含量也不會造成損傷。

圖4 大鼠腎臟凍融脫細胞前后彈性蛋白免疫組化（×100）Fig.4 Elastin immunohistochemistry of rat kidneys before and after freeze-thaw decellularization (×100)

通過考馬斯亮藍法可進行蛋白質(zhì)的定量檢測。如圖5所示，通過對新鮮對照組與實驗組進行誤差分析可以發(fā)現(xiàn)實驗組與新鮮組均存在顯著性差異，說明實驗組在凍融脫細胞過程中還存在一定的蛋白質(zhì)損失，導致這個結(jié)果可能是因為在凍融法脫細胞后細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)與細胞及DNA等物質(zhì)一起被灌注洗脫出腎臟。但兩者并沒有數(shù)量級上的差異，且除新鮮對照組外其他實驗組之間的蛋白質(zhì)定量數(shù)據(jù)不存在顯著性差異，這說明在凍融及Triton X‐100 灌注洗脫過程中蛋白質(zhì)并沒有發(fā)生明顯的損失。脫細胞支架內(nèi)部的蛋白質(zhì)等物質(zhì)的完整對后續(xù)的再細胞化有著十分重要的作用。從當前結(jié)果來看，凍融法脫細胞能基本保留大鼠腎臟細胞外基質(zhì)大部分蛋白質(zhì)等物質(zhì)。

圖5 新鮮對照組及實驗組蛋白質(zhì)定量檢測（重復實驗組數(shù)n=3）Fig.5 Quantitative detection of protein contents in control group and experimental groups(the number of repeated experimental groups was 3)

通過對實驗樣本的膠原染色、彈性蛋白免疫組化以及蛋白質(zhì)定量可知凍融脫細胞大鼠腎臟支架的膠原、彈性蛋白以及所有蛋白質(zhì)等細胞外基質(zhì)成分基本能夠得到完整保留。細胞外基質(zhì)的完整保留對再細胞化有著非常重要的作用，有利于再生器官的制備。

2.4 不同保護劑對力學性能的影響

圖6為利用DMA 所得壓力曲線，圖7為通過數(shù)據(jù)計算所得彈性模量。對比圖7各組彈性模量數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，新鮮對照組與各實驗組與之間存在著顯著性差異，說明大鼠腎臟經(jīng)過凍融法脫細胞處理以后其內(nèi)部力學性能發(fā)生了較大的變化。其中，滲透性保護劑中DMSO 組的彈性模量數(shù)據(jù)相對比甘油組的結(jié)果要好，非滲透性保護劑中海藻糖組相比麥芽糖組結(jié)果好。這與血管網(wǎng)絡完整性的規(guī)律是一致的，說明可能大鼠腎臟脫細胞支架網(wǎng)管網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)越完整，其力學性能會更好。對比DMSO 和海藻糖組的數(shù)據(jù)可以知道，10%DMSO 組的彈性模量略微大于5%海藻糖組。從HE染色結(jié)果可知，10%DMSO組的細胞及DNA 殘留相對更多，這可能是造成10%DMSO 組彈性模量大于海藻糖組的原因。大鼠腎臟脫細胞支架內(nèi)部細胞的洗脫和血管網(wǎng)絡受到一定的損傷，可能是其力學性能發(fā)生變化的主要原因。通過對不同保護劑的力學性能分析可知，凍融脫細胞支架相較于新鮮腎臟，其力學性能會發(fā)生較大變化。結(jié)構(gòu)更加完整的脫細胞支架更有利于再生成再生器官，但力學性能的變化會與脫細胞支架的結(jié)構(gòu)有怎樣的相關(guān)性，還需進一步研究。

圖6 新鮮對照組和實驗組壓力曲線Fig.6 Pressure curves of control group and experimental groups

圖7 新鮮對照組和實驗組及彈性模量（重復實驗組數(shù)n=3）Fig.7 Elastic modulus of control group and experimental groups(the number of repeated experimental groups was 3)

3 結(jié)論

本研究利用加載兩種滲透性和兩種非滲透性保護劑來探索不同保護劑對大鼠腎臟凍融脫細胞的影響。通過CT 三維重構(gòu)，發(fā)現(xiàn)滲透性保護劑10%DMSO和非滲透性保護劑5%海藻糖對凍融脫細胞支架的血管網(wǎng)絡均能保存得比較完整。但通過HE染色切片發(fā)現(xiàn)，5%海藻糖對細胞的洗脫效果更好，10%DMSO和10%甘油、5%麥芽糖的洗脫效果較差。從Masson切片染色和彈性蛋白免疫組化及蛋白質(zhì)定量檢測來看，凍融法脫細胞支架的細胞外基質(zhì)成分基本能完整保留。綜合來看，加載5%海藻糖的凍融法脫細胞能夠制備更好的脫細胞支架，有望成為再細胞化的脫細胞支架材料。

通過加載低溫保護劑來輔助凍融法脫細胞是因為低溫保護劑對生物材料在低溫條件下有抑制冰晶的作用。但凍融法脫細胞要利用冰晶溶解細胞，同時也要利用低溫保護劑保護大鼠腎臟內(nèi)部血管網(wǎng)絡等結(jié)構(gòu)。雖然本研究對不同保護劑輔助凍融脫細胞進行了分析，但還不能完全避免器官內(nèi)部血管網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的損傷并將細胞洗脫干凈，還需要更深入地研究低溫保護劑種類及濃度和凍融工藝對凍融法脫細胞腎臟支架的影響。