肖倩倩 楊婕 羊大儒 嚴(yán)憬 韓業(yè)盛 李宗慧

摘要：目的：研究干酪乳桿菌對(duì)酒精依賴大鼠酒精戒斷反應(yīng)及復(fù)飲酒量的影響，從而深入探究在酒精依賴過程中干酪乳桿菌介導(dǎo)的酒精戒除作用。方法：健康雄性大鼠35只，所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后給予含酒精6%（V/V）的水溶液（下同），水溶液作為唯一水源24 h自由飲用，建立酒精依賴大鼠模型，建模5周后，隨機(jī)選取造模成功的28只大鼠，隨機(jī)分為模型對(duì)照組（A組），干酪乳桿菌低劑量組（B組）和干酪乳桿菌高劑量組（C組），安定水溶液陽性對(duì)照組（D組）。再通過灌胃給藥的方式進(jìn)行干預(yù)，A組大鼠灌胃普通飲用水，B、C組大鼠分別給予干酪乳桿菌4×108 CFU/（kg·d）和8×108 CFU/（kg·d），D組大鼠給予1.6 mg/kg安定水溶液，干預(yù)時(shí)間為6周，同時(shí)A、B、C、D組大鼠每隔三天給予酒精水溶液維持其酒精依賴并觀察其酒精水溶液飲用量。觀察各組大鼠在每次撤除酒精后酒精戒斷綜合征（通過酒精戒斷評(píng)分表對(duì)刻板行為、激惹性、尾巴強(qiáng)直、異常姿勢(shì)進(jìn)行評(píng)分）、大鼠在曠場(chǎng)試驗(yàn)箱5 min內(nèi)中央?yún)^(qū)所待時(shí)間、站立次數(shù)比較。結(jié)果：干酪乳桿菌干預(yù)的B、C組大鼠酒精戒斷癥狀較模型對(duì)照組有明顯差異（P<0.05），再次飲酒量也相比模型對(duì)照組顯著降低，其探究行為（站立次數(shù)）和水平動(dòng)機(jī)活度（中央?yún)^(qū)時(shí)間）與模型對(duì)照組比較，無顯著差異（P>0.05）。結(jié)論：干酪乳桿菌對(duì)酒精依賴大鼠行為可能存在影響，進(jìn)而改善酒精成癮相關(guān)癥狀，為酒精成癮治療和戒斷提供新方向。

關(guān)鍵詞：干酪乳桿菌;酒精依賴大鼠;酒精戒斷反應(yīng);腸道菌群;曠場(chǎng)試驗(yàn)

酒精依賴癥是指大劑量長(zhǎng)期飲酒使得機(jī)體對(duì)酒精產(chǎn)生了心理和生理上的隱癖[1]。臨床表現(xiàn)為強(qiáng)烈和強(qiáng)制的飲酒渴求，停止飲酒時(shí)可見酒精戒斷綜合征，主要表現(xiàn)為焦慮、煩躁、抑郁、心悸甚至震顫等戒斷癥狀。近年來發(fā)現(xiàn)腸道微生物可能在酒精依賴發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。腸道微生物參與調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、代謝內(nèi)分泌和中樞神經(jīng)遞質(zhì)及相應(yīng)受體功能[2～4]。研究腸道菌群在調(diào)控酒精依賴過程的機(jī)制，對(duì)于進(jìn)一步揭示酒精依賴的成癮機(jī)理，及找到新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。吳艷艷等[6]實(shí)驗(yàn)中，干酪乳桿菌干預(yù)后大鼠的憂郁行為明顯改善，能影響大鼠神經(jīng)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)腸道菌群。本研究參照Turchan J[5]等學(xué)者的方法建立酒精成癮大鼠模型，選用益生菌中干酪乳桿菌作為干預(yù)物，參照改良柳田知司評(píng)分表、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，初步研究干酪乳桿菌對(duì)酒精依賴大鼠戒斷反應(yīng)的影響。現(xiàn)報(bào)道如下：

1材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

35只清潔級(jí)健康雄性大鼠，體質(zhì)量（220±10）g，由長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

白酒從正規(guī)商場(chǎng)購(gòu)買，干酪乳桿菌菌株由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供，安定片由海南省第一附屬醫(yī)院提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

曠場(chǎng)反應(yīng)箱。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1 制備酒精依賴大鼠模型

模型的制備參照Turchan J等[5]方法。具體方法：模型組大鼠的飲水換成含6%（v/v）乙醇的水溶液，24 h自由進(jìn)食，每天9：00AM配置酒精溶液，連續(xù)飲用5 w，按照酒精戒斷癥狀評(píng)分表分別于停止飲用酒精4 h、6 h、24 h進(jìn)行評(píng)分，選取與正常大鼠酒精戒斷癥狀評(píng)分有顯著差別的大鼠納入實(shí)驗(yàn)組。

2.3 干酪乳酸桿菌的制備

于廣州環(huán)凱微生物有限公司購(gòu)買凍干粉形式的干酪乳桿菌活化培養(yǎng)，37℃，MRS培養(yǎng)基。

2.4 動(dòng)物分組與給藥

取造模成功的大鼠28只隨機(jī)分組，分為模型對(duì)照組、低、高濃度干酪乳桿菌組及陽性對(duì)照組共4組，每組7只。每日分別給予普通飲用水、4×108 CFU/（kg·d）、8×108 CFU/（kg·d）及安定水溶液1.6 mg/kg給予實(shí)驗(yàn)組大鼠灌胃給藥。給藥其間每3 d測(cè)一次體質(zhì)量，并隨著大鼠體質(zhì)量變化調(diào)整給藥量，一共給藥6周。所有大鼠均以普通飼料喂養(yǎng)，并自由飲水，每隔3 d給予1次酒精干預(yù)，記錄飲酒量。

2.5 酒精戒斷癥狀評(píng)分

將停止飲用酒精水溶液后6 h大鼠置入檢測(cè)箱，同時(shí)攝像并記錄5 min大鼠的自發(fā)性刻板行為、激惹性、尾巴強(qiáng)直及異常步態(tài)，每個(gè)項(xiàng)目按癥狀出現(xiàn)頻率和輕重程度分為1～4級(jí)，4個(gè)項(xiàng)目相加即為總分，總分越高戒斷癥狀越嚴(yán)重。

2.6 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

曠場(chǎng)試驗(yàn)反映動(dòng)物動(dòng)機(jī)行為。將大鼠放置在曠場(chǎng)中心內(nèi)，觀察10 min，記錄后5 min內(nèi)動(dòng)物爬格數(shù)，以動(dòng)物多于1/3的身體超過線而在不同的格子內(nèi)為過線，爬過一格得1分;動(dòng)物站立次數(shù)，以動(dòng)物雙前腿起，重量全在后腿上為站立，站立一次為1分。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析處理數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以（±s）表示。

4結(jié)果

4.1 造模情況

大鼠連續(xù)飲用酒精水溶液28 d后大部分大鼠造模成功，與造模前酒精戒斷癥狀評(píng)分有顯著差異。

4.2 灌胃干預(yù)后大鼠酒精戒斷癥狀變化

給藥前各組大鼠酒精戒斷癥狀評(píng)分比較，無明顯差異。于第三周時(shí)B、C組大鼠酒精戒斷癥狀評(píng)分開始與A組有明顯差異，D組大鼠第二周時(shí)酒精戒斷癥狀評(píng)分即有明顯差異，于第五周時(shí)B、C組大鼠酒精戒斷癥狀評(píng)分下降明顯。

4.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

干預(yù)前后其行為學(xué)未見明顯差異。

4.4 飲酒量變化

在干預(yù)前各組飲酒量無明顯差異，干預(yù)后不同時(shí)間單位干預(yù)下A組飲酒量（X=155.6 ml）明顯高于C組（X=116.2 ml）、D組（X=136.7 ml）飲酒量。

5討論

本研究采用含6%酒精水溶液作為唯一飲水源，建立穩(wěn)定的酒精依賴大鼠模型。模擬人類酒精戒斷過程。本研究結(jié)果顯示，給予灌胃低、高濃度干酪乳桿菌的酒精依賴大鼠，其酒精戒斷癥狀評(píng)分明顯低于對(duì)照組;與安定水溶液組相比，高濃度干酪乳桿菌與其酒精戒斷癥狀評(píng)分無顯著差異;而再次給高濃度干酪乳桿菌組酒精水溶液時(shí)其飲酒量明顯低于對(duì)照組，相比于安定組，其飲酒量也較低。說明干酪乳桿菌能明顯改善酒精依賴大鼠的酒精戒斷癥狀，其效與安定水溶液類似。但對(duì)大鼠再次飲酒量有明顯降低作用，其效果明顯優(yōu)于安定水溶液。表明干酪乳桿菌對(duì)酒精依賴大鼠的酒精戒斷癥狀有明顯改善作用，并可減少再次飲酒時(shí)的飲酒量?？赡苁桥c干酪乳桿菌可影響酒精依賴相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)，及調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA軸），并影響某些炎癥介質(zhì)有關(guān)。有研究顯示，酒精攝入后可引起多巴胺、五羥色胺的濃度改變，從而改變大腦興奮性，引起焦慮抑郁情緒和沖動(dòng)性增強(qiáng) ，而人體腸道可分泌多種神經(jīng)遞質(zhì)，在5-HT、GABA和多巴胺合成發(fā)揮重要作用，干酪乳桿菌可能通過這種機(jī)制影響神經(jīng)遞質(zhì)合成，從而影響酒精依賴大鼠的行為。目前，酒精依賴患者停止飲酒出現(xiàn)焦慮抑郁等戒斷癥狀，成為臨床酒精戒斷的一大阻力，多采用苯二氮卓類藥物用于緩解臨床癥狀減輕其焦慮情緒，但其副作用及成癮性成為其一大弊端。而干酪乳桿菌作為一種益生菌對(duì)酒精依賴患者并無副作用，能調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)而改善酒精戒斷癥狀，這為腸道菌群介導(dǎo)的酒精依賴深入研究及治療酒精戒斷癥狀的新藥提供了新的方向。

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