吳天賜，李楠，張娟，余意，劉振民*

1(光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)生物技術國家重點實驗室，上海乳業(yè)生物工程技術中心，上海，200436)2(上海大學 生命科學學院，上海，200444)

假單胞菌是原料乳中普遍存在的嗜冷菌菌群，因其能在低溫條件下正常生長繁殖，產生耐熱蛋白酶和耐熱脂肪酶，被認為是原料乳中具有極大危害性的菌群之一[1-3]。假單胞菌所產的堿性金屬蛋白酶(alkaline metalloproteinase)是其中一種常見的耐熱胞外蛋白酶，這種酶受到aprX基因的調控且無法通過巴氏殺菌和超高溫滅菌完全滅活，可導致乳制品在貨架期內出現(xiàn)凝乳、發(fā)苦等[4]。隨著研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)多類假單胞菌中存在相同或類似的蛋白酶基因，這些假單胞菌對原料乳及乳制品存在一定的潛在危害[5-7]。

我國對于原料乳中嗜冷假單胞菌的檢測方法依賴于傳統(tǒng)的平板計數方法[8]，主要根據理化性質來判斷，此方法存在檢測周期長、重復性不好和容易漏檢等缺點，很容易錯過檢測的最佳時期。PCR檢測技術因其快速、高效等特點已經被運用于食品中危害性微生物的檢測。將16S rRNA[9]和rpob基因[10]等作為特異性靶點進行PCR檢測假單胞菌已被廣泛報道。sucD基因是琥珀酰輔酶A合成酶的α亞基編碼基因[11]，以sucD基因作為靶點檢測假單胞菌的研究非常少。研究[12]發(fā)現(xiàn)sucD基因在假單胞菌屬內存在較高的同源性，可作為假單胞菌檢測靶點。此外，MARCHAND等[13]研究表明將aprX基因作為靶點能夠穩(wěn)定可靠的檢測假單胞菌。

多重PCR技術是PCR技術的一種，在一個反應體系中加入2對或2對以上引物，可同時針對多個靶點進行擴增[14]。因為多重PCR與常規(guī)單一PCR相比，具有省時、低成本和高特異性等優(yōu)點，在臨床醫(yī)學、農業(yè)和食品行業(yè)等領域的檢測都已得到廣泛的運用[15-17]。隨著我國乳制品行業(yè)引入冷鏈系統(tǒng)后，假單胞菌類嗜冷菌對原料乳的危害越發(fā)明顯，但遲遲沒有合適的解決方案。本研究將致力于針對2個目的基因，建立一種能夠快速檢測原料乳中具有產蛋白酶能力假單胞菌的雙重PCR檢測方法，并對反應體系進行優(yōu)化和評價。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

實驗所用菌株見表1，菌株均為-80 ℃甘油保存。

表1 實驗菌株Table 1 Strains used in the study

細菌基因組DNA提取試劑盒、通用型DNA純化回收試劑盒，天根生化科技有限公司；100 bp DNA Marker以及TaqDNA聚合酶等PCR反應試劑，Takara；酵母提取物，阿法埃莎(Alfa Aesar)化學有限公司；牛肉膏，上海盛思生化科技有限公司；蛋白胨，國藥集團化學試劑有限公司；NaCl固體、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉(均為分析純)、蛋白肽，國藥集團化學試劑有點公司；特異性引物合成及基因測序由生工生物工程(上海)有限公司完成。

NB培養(yǎng)基：0.3%(質量分數，下同)牛肉膏，1%蛋白胨，0.5% NaCl固體，2%瓊脂粉，pH為7.0；脫脂乳培養(yǎng)基：0.5%酵母提取物、2%脫脂乳粉、1.5%瓊脂粉；增菌液[18]：1%蛋白胨，0.5% NaCl固體，0.35%磷酸二氫鈉，0.15%磷酸二氫鉀，最終pH為7.2±0.2。

Veriti Thermal Cycler 96-well PCR儀，美國Applied Biosystems公司；BIO-RAD GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)，上海安景科技有限公司；HVE-50型高壓滅菌鍋，日本HIRAYAMA公司；SG-402TX型超凈工作臺，美國THE BAKER COMPA-NY公司；Minispin Plus離心機，德國Eppendorf AG公司；HE-120核酸電泳儀，上海天能科技有限公司；AL104電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；PHS-25型pH計，美國奧立龍公司；XW-80A型漩渦混合儀，上海青浦滬西儀器廠；HZQ-X500C恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；NanoDrop 2000C分光光度計，美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設計

根據文獻中提到的蛋白酶基因aprX和琥珀酰輔酶A合成酶α亞基編碼基因SucD，在NCBI數據庫中下載多條假單胞菌株靶點基因序列，利用MEGA X軟件進行ClustalW序列對比，分析基因的保守序列，再應用Primer premier 5.0和Oligo 7對保守序列進行引物設計，盡量減少引物間的二聚體形成，并分析了最佳退火溫度，通過NCBI中Primer-BLAST功能對比，篩選了2對特異性較好的引物(表2)。引物由上海生工生物工程有限公司合成，擴增片段大小依次為232、415 bp。

表2 PCR引物信息Table 2 Information about the PCR primers

1.2.2 細菌基因組DNA提取

不同的實驗中，分別采用試劑盒法或煮沸法[9]提取細菌基因組DNA。

測試菌株采用試劑盒法提取基因組DNA，使用推薦固體培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度活化，挑取單菌落接種至液體培養(yǎng)基在恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，取1.5 mL菌液，按照天根生化科技有限公司的細菌基因組DNA提取試劑盒操作說明進行細菌基因組DNA提取，保存于-20 ℃下，作為PCR模板。原料乳及模擬樣品采用煮沸法提取基因組DNA：取8 000×g離心5 min，棄上清液，用200 mL無菌水重懸菌體，在100 ℃煮沸10 min，立即放入-20 ℃冰箱冷卻，20 000×g離心10 min，上清液即為細菌基因組DNA。

1.2.3 單重PCR反應體系建立

單重PCR反應體系(50 μL)：10×Buffer 5 μL，dNTP(deoxy-ribonucleoside triphosphate) Mixture(各2.5 mmol/L)4 μL，Taq酶(5 U/μL)0.25 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板1 μL(以產氮假單胞菌BNCC 133928基因組DNA為模板，此類為前期從原料乳中分離嗜冷菌時出現(xiàn)較多的菌)，ddH2O補足50 μL。反應條件如下：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物，采用1%(質量分數)瓊脂糖凝膠(含Gelred染料)，在100 V下電泳30 min，將目的條帶割膠回收送至上海生工測序。

1.2.4 雙重PCR反應體系建立及條件優(yōu)化

以標準菌株BNCC 133928產氮假單胞菌基因組DNA作為模板，與各種PCR反應試劑混合，主要針對退火溫度、引物濃度配比和Taq酶量來完成雙重PCR反應體系建立和條件優(yōu)化。

1.2.5 特異性檢測

將表1中所有菌株的基因組DNA作為模板，進行雙重PCR擴增，并以ddH2O作為空白對照。以此判斷此方法對常見致病菌和原料乳中常見細菌的特異性。同時陽性條帶割膠回收送至上海生工測序。

1.2.6 靈敏度檢測

使用NanoDrop 2000超微量分光光度計測定標準菌株產氮假單胞菌DNA核酸濃度，使用ddH2O進行10倍梯度稀釋，分別取不同濃度DNA 各1 μL作為模板進行雙重PCR，檢測雙重PCR反應體系的靈敏度。

1.2.7 人工模擬污染原料乳檢測

將活化的產氮假單胞菌接種1環(huán)至NB培養(yǎng)基中30 ℃下培養(yǎng)24 h，10倍梯度稀釋，對10-5、10-6、10-7、10-8、10-9稀釋梯度進行平板計數，平行3次。參照MARTINS等[19]的方法模擬原料乳污染實驗，將菌液用120 g/L脫脂乳梯度稀釋，得到菌液濃度為101、102、103、104、105和106CFU/mL的模擬原料乳樣品，各取1 mL 利用煮沸法。將所提DNA分別進行雙重PCR檢測，以ddH2O作為陰性對照。模擬工業(yè)檢測中增菌處理，在225 mL增菌液中加入25 mL已滅菌的120 g/L脫脂乳，分別接入1 mL濃度為100、101、102和103CFU/mL菌液，平行3次，在30 ℃，150 r/min條件下培養(yǎng)，分別在0、4、8、12和24 h各取1 mL樣品，用煮沸法提取細菌基因組DNA，進行雙重PCR檢測。

1.2.8 實際原料乳樣品檢測

共15份來自北京、上海、廣州牧場的原料乳樣品，每份原料乳樣品取25 mL加入225 mL增菌液中，在30 ℃、150 r/min條件下?lián)u床增菌培養(yǎng)24 h。采用煮沸法提取DNA，分別作為模板，利用雙重PCR方法進行檢測。同時采用培養(yǎng)方法在6.5 ℃下培養(yǎng)7 d篩選可疑菌落，平行3次，以防漏檢，對篩選的菌株進行16S rDNA 測序鑒定，并用20 g/L脫脂乳培養(yǎng)基驗證篩選的假單胞菌是否具有產蛋白酶能力作為對照試驗。

2 結果與分析

2.1 單重PCR特異性檢測結果

使用單重PCR反應驗證引物的特異性，aprX引物aprXf/aprXr的特異性驗證，結果僅在232 bp處擴增出了預期的產物，sucD引物sucDf/sucDr的特異性驗證，結果僅在415 bp處擴增出了預期的產物，如圖1所示。上述陽性條帶割膠回收送至上海生工生物工程有限公司測序，測序結果在NCBI中BLAST在線對比，證實擴增條帶為目的片段。

2.2 雙重PCR反應體系建立及優(yōu)化

通過對退火溫度、Taq酶量和引物濃度配比優(yōu)化后，得到最佳退火溫度為57 ℃、最佳Taq酶量為0.5 μL、最優(yōu)引物濃度配比為aprX10 μmol/L，sucD7.5 μmol/L，如圖2所示。最終雙重PCR反應體系為：10×Buffer 5 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)4 μL，Taq酶(5 U/μL)0.5 μL，aprXf/aprXr各1 μL(10 μmol/L)，sucDf/sucDr各1 μL(7.5 μmol/L)，DNA模板1 μL，ddH2O補足50 μL。反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

2.3 雙重PCR特異性檢測結果

表1中所有菌株基因組DNA進行雙重PCR反應，結果顯示在目標區(qū)域內1～14號陽性菌株均能擴增出2條清晰的目的條帶；15號惡臭假單胞菌在目標區(qū)域內擴增出1條415 bp條帶(30 ℃下培養(yǎng)48 h不產蛋白酶，圖3)；其余陰性菌株均未擴增出目的片段，如圖4所示，經測序結果在線比對，證實確為目的片段，表明本實驗雙重PCR方法特異性良好。

2.4 靈敏度檢測結果

所提取的標準菌株產氮假單胞菌基因組DNA以10倍梯度稀釋至10-6，以各梯度為DNA模板進行雙重PCR反應，結果如圖5所示，當反應體系中DNA模板最終質量濃度為1.67×10-2pg/μL時，未能擴增出目標條帶，因此本方法的檢測限為1.67×10-1pg/μL。

2.5 人工模擬污染原料乳樣品的檢測結果

培養(yǎng)24 h后所得到的菌液初始濃度為3.5×108CFU/mL，將菌液用120 g/L脫脂乳分別稀釋至3.5×101、3.5×102、3.5×103、3.5×104、3.5×105和3.5×106CFU/mL，模擬被假單胞菌污染的原料乳，各取1 mL采用煮沸法提取細菌基因組DNA后進行雙重PCR反應，結果當菌液濃度達到3.5×106CFU/mL時，能夠清晰檢測出2條目的條帶。當樣品經過增菌后，發(fā)現(xiàn)當增菌12 h后，在菌液濃度為3.5×103CFU/mL 的樣品中檢測到了2條陽性條帶，當增菌24 h后，在所有樣品中均檢測出了2條陽性條帶，如圖6。所以在適當的增菌處理后，本方法的檢測限可達到3.5 CFU/mL，檢測靈敏度高且效果良好。

2.6 實際原料乳樣品檢測

采集15份原料乳樣品，檢測結果如表3所示。經培養(yǎng)法篩選后，測序檢測及驗證，結果僅有5份樣品檢出產蛋白酶假單胞菌，檢出率為30%。而通過雙重PCR方法，有10份樣品檢出2條清晰陽性條帶且無非特異性擴增，檢出率為60%。相比之下，本研究所建立的方法更加省時且準確率高。

表3 原料乳樣品檢測結果Table 3 Detection results of the raw milk samples

3 結論與討論

目前我國乳制品行業(yè)的冷鏈運輸技術沒有達到成熟階段，無法保證所有環(huán)節(jié)的冷藏溫度不產生較大的波動，這可能導致假單胞菌的大量繁殖并產生蛋白酶[20]。原料乳中危害性假單胞菌在運輸貯藏等過程中所產生的耐熱蛋白酶等無法通過巴氏滅菌和超高溫滅菌完全清除，這是產蛋白酶假單胞菌對乳造成危害的主要原因之一[21]。快速檢測原料乳中具有危害性的假單胞菌并通過一定手段進行控制，將有效地提高原料乳品質。在實際工業(yè)檢測中，與傳統(tǒng)的PCR檢測技術相比，雙重PCR方法能夠有效避免“假陽性”，并且具有省時、特異性高、靈敏性高等特點。

本研究結合NCBI數據庫中多種假單胞菌的sucD基因和aprX基因序列，利用軟件進行序列分析，篩選出2對具有特異性較高且適用于雙重PCR的引物，建立了檢測效果顯著的雙重PCR方法。胡冰雪等[22]針對熒光假單胞菌gyrB基因、沙門氏菌invA基因和單增李斯特菌的hlyA基因所建立的m-PCR，經優(yōu)化后純菌DNA檢測限為1 pg/μL，增菌培養(yǎng)后熒光假單胞菌、沙門氏菌和單增李斯特菌檢測水平分別為9、5和70 CFU/mL。本研究建立的方法對純菌DNA的檢測限為0.167 pg/μL，經24 h增菌培養(yǎng)后檢測限可達到3.5 CFU/mL。

本方法經過驗證具有很高的特異性和靈敏度，相對于傳統(tǒng)培養(yǎng)篩選的方法能夠節(jié)省大量時間、試劑等。實際檢測中無需使用試劑盒，僅通過煮沸法提取DNA即可進行檢測，可有效的降低成本，能夠滿足工業(yè)中快速檢測的要求。此方法可應用于乳制品行業(yè)的原料乳中產蛋白酶假單胞菌檢測，為奶業(yè)等控制產蛋白酶假單胞菌具有借鑒價值。