張二豪，趙潤東，祿亞洲，尹秀，蔡皓，羅章

(西藏農牧學院 食品科學學院，西藏 林芝，860000)

藏東南地區(qū)主要包括林芝和昌都地區(qū)，其獨特的地理位置形成了特殊的氣候類型，適合葡萄種植和釀造葡萄酒，素有“中國野生紅葡萄之鄉(xiāng)”和“水果之鄉(xiāng)”之稱。微生物在葡萄種植和釀酒過程中扮演著養(yǎng)分吸收和能量轉化的重要角色，是葡萄生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分[1]。有研究表明土壤微生物在促進植物生長、提高土壤肥力、植物健康和物質運輸及轉化過程中發(fā)揮重要作用[2]，CHAUDHRY等[3]研究發(fā)現較高豐度的變形菌門(Proteobacteria)有助于土壤養(yǎng)分積累和植物生長。由于釀造葡萄酒是一個復雜的微生物發(fā)酵過程，其微生物主要來源于葡萄表面、種植土壤和發(fā)酵設備[4-5]。MARTINS等[6]研究葡萄表皮附著微生物時發(fā)現假單胞桿菌屬(Pseudomonas)普遍存在于葡萄中，同時還發(fā)現土壤微生物與葡萄上的微生物存在一定的聯系；BOKULICH等[7]在研究葡萄汁微生物時發(fā)現糖桿菌屬(Gluconobacter)具有促進脂類物質合成、改善酒的風味和質量的功效。因此，葡萄表皮及根際土壤存在與釀酒及種植相關的重要微生物類群。

本研究中，所有實驗均重復 3次，結果以均值(means)±標準偏差(SD)表示。所得實驗數據運用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析與統(tǒng)計處理，p＜0.05為具有統(tǒng)計差異。

葡萄表皮和土壤微生物種類與其生長環(huán)境息息相關，有研究表明，不同氣候類型或地理位置其葡萄表皮和土壤微生物種類存在顯著差異[8-10]，藏東南獨特的地理氣候環(huán)境勢必蘊藏著豐富的微生物資源。目前中國各地葡萄產區(qū)的微生物群落已被廣泛深入研究,但西藏藏東南葡萄產區(qū)微生物群落結構及多樣性尚未見報道。

營養(yǎng)品質：2016年6月21日刈割后，自然風干恒重的草樣用不銹鋼粉碎機粉碎，過1 mm篩，從粉碎后混合均勻的植株樣中取3個樣品，平行測定各項指標。苜蓿中粗蛋白采用半微量凱氏法，粗脂肪采用抽提殘余法，粗灰分采用直接干灰化法，酸性洗滌纖維采用范式酸-洗滌劑法[18]，中性洗滌纖維采用范式中性-洗滌劑法[19]。

近年來，高通量測序技術由于其準確性高、通量大的優(yōu)點，在微生物學領域得到了廣泛的應用和發(fā)展[11-12]。為了研究藏東南葡萄產區(qū)細菌種類和豐度，本文采用高通量測序技術，對藏東南2個地區(qū)葡萄園中的葡萄和土壤細菌群落組成和多樣性進行了分析，以期分析不同產區(qū)，不同生態(tài)系統(tǒng)中細菌群落間的生態(tài)聯系和相互作用，為藏東南優(yōu)良釀酒細菌的篩選和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

林芝葡萄(LP)、林芝葡萄根際土壤(LS)、芒康葡萄(MP)和芒康葡萄根際土壤(MS)；DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen，Germantown，MD，USA)；ThermusAquaticus(Taq)，天根生化科技(北京)有限公司；膠回收試劑盒，美國Omega公司；瓊脂糖、Qubit2.0 DNA檢測試劑盒，美國Invitrogen公司。

1.2 儀器與設備

NanoDrop2000微量分光光度計，美國Thermo公司；5418R高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-rad公司；電泳儀，北京六一；Hiseq測序平臺，美國Illumina公司。

1.3 材料與方法

葡萄根際土壤理化性質如表1所示，MS樣品中TP、TK、TN、AN、EC和SOM含量均顯著高于LS，但AP含量顯著低于LS，兩地根際土壤pH在6.753～7.183，呈中性?？傮w而言，MS樣品中土壤營養(yǎng)成分明顯高于LS，LS樣品以沙土為主，而MS樣品主要以腐殖土為主，不同根際土壤理化性質差異可能與兩地根際土壤性質和施肥管理措施有關。

為了分析不同樣品中細菌群落結構特征，對不同樣品進行了主坐標分析(principal coordinate analysis， PCoA)。如圖3所示，PC1(41.62%)能夠很好的區(qū)分葡萄和土壤樣品，而不同種源地根際土壤樣品更易被PC2(23.17%)區(qū)分，不同樣品點之間距離有明顯分離，說明不同樣品中細菌群落結構存在差異。相比之下，LP和MP距離較近，說明細菌群落結構相似性較高，而LS和MS距離較遠，說明相似性較低且組間差異大于組內差異。結合土壤理化性質分析結果來看，土壤營養(yǎng)成分的差異可能是導致根際土壤細菌群落結構差異的主要原因。

新鮮葡萄和土壤樣品來自昌都芒康(緯度29°1′53.1″N，經度98°36′21.77″E)和林芝(緯度29°25′33.37″N，經度94°26′50.93″E)，于2019年8月采集，每組3個重復。將采集到的樣品裝入無菌袋中，低溫保存并帶回實驗室，24 h內處理。根際土壤過2 mm的過濾篩以除去殘枝落葉并自然風干，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 不同種源地葡萄根際土壤樣品理化性質分析

土壤理化性質測定采用常規(guī)檢測方法[13]，測定指標主要包括pH、總磷(total phosphorus，TP)、總鉀(total potassium，TK)、總氮(total nitrogen，TN)、速效氮(available nitrogen，AN)、速效磷(available phosphorus，AP)、電導率(conductivity，EC)和有機質(soil organic matter，SOM)含量。土壤pH檢測采用電位法，總磷和速效磷檢測采用鉬銻抗比色法，總鉀和速效鉀檢測采用火焰光度計法，總氮檢測采用凱氏定氮法，速效氮檢測采用堿解擴散法，電導率測定采用電極法，有機質測定采用重鉻酸鉀水合熱法。

原始數據經數據過濾除去低質量的reads以獲得 Clean data；通過reads間的Overlap將reads拼接成Tags;在97%相似水平下對Tags進行可操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)聚類,采用RDP classifier貝葉斯算法對OTUs序列進行分類學分析。采用Mothur 1.30.2對樣品的Alpha多樣性進行分析，包括群落覆蓋度、Chao1指數、香農指數、辛普森指數和Shannoneven等指數，Chao1指數值越大，說明群落豐富度越高，利用Qiime計算Beta多樣性和主坐標分析(principal coordinates analysis，PCoA)[14]；Venn圖利用R語言工具統(tǒng)計和作圖；用R語言vegan包進行冗余分析(redundancy analysis，RDA)和熱圖制作；利用PICRUSt軟件包對所有樣本的微生物群落進行功能預測。

組織和土壤樣品總DNA的提取使用DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen，Germantown，MD，USA)，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的質量并用NanoDrop ND-2000紫外分光光度計檢測DNA的濃度和純度。

1.3.4 樣品PCR

利用338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCA)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)對細菌16S rDNA進行PCR擴增,引物由上海美吉生物有限公司合成。PCR擴增采用25 μL反應體系:10×PCR Buffer 2.5 μL，338F和806R引物各1 μL，5 mmol/L dNTPs 1 μL，5.0 U/μLrTaq酶0.25 μL，DNA模板1 μL，ddH20 18.25 μL。PCR反應程序如下：95 ℃ 5 min；35個循環(huán)(95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s)，72 ℃ 10 min。2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并純化PCR產物，將純化的PCR產物送至上海美吉生物醫(yī)藥有限公司進行測序。

1.3.5 數據統(tǒng)計與分析

為大力推廣熊蜂授粉與病蟲害綠色防控技術，促進農業(yè)綠色發(fā)展，助力鄉(xiāng)村振興，按照省農業(yè)廳植保植檢站《關于印發(fā)河北省蜜蜂授粉與綠色防控技術集成示范方案的通知》的要求，2017年在全縣開展熊蜂授粉與病蟲害綠色防控技術集成示范。

建造角色視野下民居建造方式的演變研究——基于貴州省雨布魯村石構民居的案例 吳桂寧 黃 文2018/04 63

1.3.3 樣品總DNA的提取

2 結果與分析

在屬分類水平上，樣品中細菌隸屬713屬，在相對豐度≥1.00%條件下，LP樣品中有9個屬，其優(yōu)勢屬是伯克氏菌屬(Burkholderia)(27.60%)，其次是脆弱擬桿菌(Muribaculaceae)(5.34%)，而MP樣品中有10個屬，葡萄糖桿菌屬(Gluconobacter)(22.53%)是優(yōu)勢屬，其次是冰凍小桿菌屬(Frigoribacterium)(14.14%)和泛菌屬(Pantoea)(13.52%)；在相對豐度≥1.00%下， LS樣品中有10個屬，節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)(11.49%)是優(yōu)勢屬，其次是腸桿菌屬(Enterobacteriaceae)7.43%和類諾卡氏菌屬(Nocardioides)5.15%，而MS樣品中有12個屬，其優(yōu)勢屬是Gaiella(5.17%)，其次是Llumatobacteraceae(4.43%)(圖1-b)。Venn分析結果表明，根際土壤細菌種類最多(圖2-a)，各樣品間共有64個屬，不同種源地間葡萄樣品共有133個屬，LP特有屬55個，MP特有屬32個；不同種源地間土壤共有310個屬，LS中有118個特有屬，而MS中有98個特有屬。LP和LS共有137個屬，而MP與MS共有110個屬(圖2-b)，說明不同種源葡萄和根際土壤細菌群落結構既存在共性又存在差異。

從表1可知，華東師范大學的季瀏老師是發(fā)文量最多的作者，達到了17篇，其中有2篇獨立完成，15篇合作完成，研究的主題主要是體育課程、績效評價等。其次是華東師范大學的汪曉贊老師，發(fā)文10篇，全是合作完成，她研究的主題是體育課程標準、課程評價等。排名第3的是北京體育大學的姚蕾老師發(fā)表7篇，獨立完成4篇，研究的主題涉及學校體育、體育教學評價等。由此可知，這些核心作者發(fā)文通常是以與他人合作的方式，研究的主題也涉及廣泛，但同時涉及了體育教學評價這一研究主題。表1中排名前10的核心作者中有5位作者是屬于體育類師范院校，其中華東師范大學有3位作者，因此華東師范大學為體育教學評價領域的研究做出了突出的貢獻。

表1 不同樣品根際土壤理化性質Table 1 Rhizosphere soil physical and chemical properties of different samples

2.4 不同樣品中細菌多樣性分析

高通量測序結果如表2所示，LP、LS、MP和MS分別獲得有效序列數為38 986、26 430、29 267和27 556，產生的OTUs分別為463、1 247、310和1 448。相對而言，葡萄中獲得的有效序列數最多，產生的OTUs個數最少，而根際土壤中獲得的有效序列數最少，但產生的OTUs個數最多，說明葡萄中大部分有效序列被聚類到個別OTU。Alpha多樣性分析表明，MS中細菌均勻度指數、豐富度指數和多樣性指數最高，葡萄樣品中LP的均勻度指數和多樣性指數顯著高于MP，而豐富度指數低于MP。以上結果表明，不同種源地葡萄和根際土壤細菌多樣性指數差異顯著，根際土壤細菌群落種類最多、最為復雜。覆蓋度檢測結果代表了每個樣本的測序深度，反映了樣本中細菌的真實情況。LP、LS、MP和MS的測序覆蓋度均超過99%，說明此次測序結果基本能反映樣品中細菌的真實情況。

兩個人同時吆喝著出手，徐藝出的是布，左達出的是剪子。徐藝緊張地看著左達，左達笑著看著徐藝，說：“你太緊張了，可惜，我用五十萬只贏了一個錢包?！?/p>

表2 不同樣品中細菌群落多樣性指數分析Table 2 Diversity index of bacteria community in the different samples

2.3 實驗樣品細菌群落結構分析

細菌在門分類水平的相對豐度如圖1-a所示，Proteobacteria是葡萄表皮的優(yōu)勢門，其相對豐度為52.34%～69.08%，次優(yōu)勢菌是放線菌門(Actinobacteria)，其相對豐度為21.31%～26.99%；而根際土壤中優(yōu)勢菌門則相反，為Actinobacteria，次優(yōu)勢菌門是Proteobacteria，其相對豐度分別為44.18%～44.60%和21.41%～36.22%，說明不同樣品間群落組成相似但相對豐度差異較大。

2.1 不同種源地葡萄根際土壤理化性質分析

2.2 實驗樣品細菌序列統(tǒng)計及多樣性分析

1.3.1 樣品采集及處理

1 水痘疹子多發(fā)于軀干、頭部，四肢較少。先是紅色斑疹，1天后變成丘疹，幾個小時后會變成水皰疹，水皰破裂后結痂，沒有新疹子出現以及舊疹子都結痂了就算是痊愈。如果發(fā)現疹子變成水皰疹，應立即去醫(yī)院找醫(yī)生確認一下是不是水痘。

2.5 細菌群落結構與環(huán)境因子的冗余分析

為了分析環(huán)境因子對細菌群落結構的影響，對環(huán)境因子和不同樣品進行了冗余分析(redundancy analysis，RDA)。結果如圖4所示，TN、TP、TK，AN和pH對樣品中細菌群落結構影響較大，而AP，EC和SOM對細菌群落結構影響不明顯，其中TN含量對細菌群落結構影響最大，TK含量對細菌群落結構影響最小，MP、MS和LS與TN、TP、TK、AN和pH呈正相關，而LP呈負相關，說明氮、磷、鉀和pH是影響葡萄和根際土壤細菌群落結構的關鍵因素。伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)細菌與TN、TP、TK、AN和pH呈負相關，而醋酸菌科(Acetobacteraceae)細菌相反，Enterobacteriaceae與pH呈負相關，而與其他土壤成分呈正相關，說明土壤營養(yǎng)成分含量決定了細菌群落的相對豐度。

2.6 細菌群落功能預測分析

據了解，武漢帆程恒通餐飲管理有限公司每年都定期組織工作人員參加消防安全培訓和消防演習活動，以強化餐飲工作人員的工作安全意識和防患意識。為保障校園食品安全質量，該公司更是重磅出擊，從原料采購、生產加工到銷售等各個環(huán)節(jié)都嚴格把關，做好送檢和抽檢工作，時刻將保障消費者舌尖上的安全作為重心，放在首位。

為了分析2個種源地葡萄和土壤細菌的功能組成變化，本文利用PICRUSt軟件對細菌功能進行預測分析。結果如圖5所示，共獲得24項COG功能分組，其相對豐度隨樣品的不同而不同，主要參與氨基酸轉運和代謝、轉錄、碳水化合物轉運和代謝及能量生產和轉換。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析結果如表3所示，在第2等級功能上，樣品細菌群落主要參與氨基酸代謝、碳水化合物代謝、能量代謝、脂類代謝和輔助因子、維生素代謝且葡萄表皮細菌相對豐度均高于根際土壤微生物，有研究表明，脂類物質的合成有助于改善葡萄酒的口感[7]，

表3 第2等級功能水平上細菌群落的KEGG代謝通路豐度Table 3 KEGG metabolic pathway abundance of bacterial community at the pathway level 2

在本文中也發(fā)現具有較高相對豐度的細菌參與脂類代謝，說明葡萄表皮微生物在葡萄酒釀造過程中扮演著重要角色。同時還發(fā)現部分細菌參與抗生素和植物激素類物質的生物合成，說明其可能參與植物生長和病害防治。

3 討論

酵母菌和細菌在葡萄酒發(fā)酵過程中扮演者重要角色，其主要來源于葡萄表面和種植土壤[4-5]，因此為提高葡萄酒品質，分離本地釀酒微生物成為人們研究的熱點。本研究利用高通量測序技術對藏東南2個種源地葡萄和土壤細菌群落結構和多樣性進行了分析。土壤作為一個天然的微生物資源庫，為微生物提供了必需的營養(yǎng)物質(如碳源、氮源和生長因子)，致使其微生物種類復雜多樣[6,15]。魏玉潔等[8]研究表明無論是細菌還是真菌，土壤中微生物種類和數量最多，在本研究中得到了類似的實驗結果，2個種源地根際土壤中所獲得的OTUs最多，同時其多樣性指數、均勻度指數和豐富度指數最高且MS大于LS。本研究發(fā)現根際土壤細菌的優(yōu)勢門是變形菌門和放線菌門，研究表明，土壤微生物在門分類水平上優(yōu)勢細菌門基本相似，主要包括10種左右的細菌類群[16]，如變形菌門、放線菌門和酸桿菌門，楊敏等[17]通過研究香格里拉葡萄酒產區(qū)葡萄根際微生物時發(fā)現根際土壤的優(yōu)勢門是變形菌門、放線菌門和酸桿菌門，而本研究發(fā)現酸桿菌門(Acidobacteria)在MS(10.28%)中的相對豐度顯著高于LS(2.22%)，這可能與MS中含有較高的氮源有關[18]；張世偉[1]在研究不同品種釀酒葡萄表皮微生物時發(fā)現變形菌門和放線菌門是葡萄表皮的優(yōu)勢細菌門，這與本研究結果一致。

HIRANO等[19]和PARK等[20]研究表明，凱氏桿菌(Kaistobacter)、Arthrobacter和鞘氨醇單胞菌 (Sphingomonas)是土壤中的優(yōu)勢類群，而楊敏等[17]研究表明，香格里拉葡萄園根際土壤的優(yōu)勢細菌屬是紅游動菌屬(Rhodoplanes)、擬桿菌屬(Bacteroides)、硝化螺旋菌門(Nitrospira)和類固醇桿菌(Steroidobacter)，魏玉潔等[8]研究發(fā)現吐哈盆地葡萄園土壤中優(yōu)勢屬是Kaistobacter、Arthrobacter和 克氏菌(Skermanella)；上述研究結果表明，不同地區(qū)根際土壤細菌優(yōu)勢類群存在明顯的差異，可能與地理環(huán)境和土壤理化性質差異有關[8-10]。張世偉[1]研究不同品種葡萄表皮微生物群落結構時發(fā)現，歐文氏菌屬(Erwinia)、假單胞菌(Pseudomonas)和芽孢桿菌(Bacillus)是優(yōu)勢屬，而新疆葡萄表皮細菌的優(yōu)勢屬以Pseudomonas、Sphingomonas和桿菌屬(Adhaeribacter)為主[8]，但本研究發(fā)現LP樣品中的優(yōu)勢屬是Burkholderia和Muribaculaceae，而MP樣品中的Gluconobacter，Frigoribacterium和Pantoea是優(yōu)勢屬，這與前人研究結果差異較大，藏東南獨特的地理環(huán)境和氣候類型可能是造成葡萄表皮微生物類群差異的關鍵因素。

大港油田積極響應中國石油“穩(wěn)健發(fā)展”和“保持一億噸以上原油產量規(guī)?！钡陌l(fā)展戰(zhàn)略，堅持把提高采收率增加老油田可采儲量作為油氣開發(fā)的核心價值觀，規(guī)模開展高孔高滲、高溫高鹽、深層低滲三大類油藏的開發(fā)試驗，大幅度提高老油田采收率，努力把資源優(yōu)勢轉化為產量優(yōu)勢和發(fā)展優(yōu)勢，努力實現產量穩(wěn)定和可持續(xù)發(fā)展。

結合實際所能得到數據情況，以市州作為決策單元研究某一年的發(fā)展情況。選取化肥施用量(X1)、農牧漁業(yè)從業(yè)人員(X2)、農業(yè)機械總動力(X3)、有效灌溉面積(X4)、農業(yè)機械總動力(X5)、農業(yè)用電量(X6)為投入指標，同時以農牧漁業(yè)增加值(Y1)、農民人均純收入(Y2)、糧食產量(Y3)為產出指標來評價市州的農業(yè)循環(huán)經濟發(fā)展情況。

根際土壤細菌以放線菌門和變形菌門為主，其中變形菌門具有促進土壤氮循環(huán)和植物生長的功能[3]，研究結果表明根際土壤中含有較多的Nocardioides，Enterobacteriaceae和少量的中生根瘤菌(Mesorhizobium)，有研究表明Nocardioides具有抑制病原菌和降解有毒物質的作用[21]，Enterobacteriaceae具有抑制黃曲霉生長和減緩黃曲霉毒素的作用[22]，而Mesorhizobium具有固氮和促進植物生長的作用[23]，說明LS和MS根際土壤狀態(tài)良好。參與葡萄酒釀造過程中的細菌主要是乳酸菌，如乳桿菌、片球菌、酒類酒球菌和植物乳桿菌等[24-25]，本文在葡萄表皮檢測到了一定數量的乳桿菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、Leuconosto和Weissella，其中Lactobacillus和Lactococcus是決定發(fā)酵成功的關鍵，具有產酸、細菌素、維生素和香氣物質的功能，這些物質直接影響了發(fā)酵食品的營養(yǎng)成分和口感[26]，而Leuconosto和Weissella在異乳酸發(fā)酵過程中產生醇類等風味物質[27-28]。本研究還發(fā)現了厚壁菌門(Firmicutes)，Firmicutes具有二次發(fā)酵，提升葡萄酒品質的功能[29]。以上結果表明葡萄表皮含有豐富的釀酒微生物且對葡萄酒的品質和口感至關重要。

綜上所述，本文首次通過高通量測序技術對林芝、芒康兩地葡萄及根際土壤細菌群落結構及多樣性進行了分析。發(fā)現土壤細菌種類和數量最多，不同種源地葡萄和土壤中細菌群落結構相似，同時還發(fā)現葡萄表皮存在較多與釀酒相關的細菌。本文對西藏葡萄和土壤細菌有了深入的了解，為西藏設施葡萄種植、釀酒細菌的篩選和利用提供了理論依據。