徐瑾，周文波，武倫，方大正

(錦州醫(yī)科大學(xué)國(guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地；湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國(guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院，湖北 十堰 442000)

甲狀腺乳頭狀癌(PTC)是一種內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤，約占甲狀腺癌病人的90%以上，是最常見(jiàn)的分化型甲狀腺癌(differentiated thyroid carcinoma，DTC)類型[1-2]。目前甲狀腺癌主要是通過(guò)體檢或者有癥狀時(shí)被發(fā)現(xiàn)，以手術(shù)治療為主[3]。該病程進(jìn)展緩慢，但仍然有部分患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，失去了最佳治療時(shí)機(jī)預(yù)后較差。

研究發(fā)現(xiàn)，RCN2可正向調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移[4]，如乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌等中均有報(bào)道[5]，作為一種鈣離子結(jié)合蛋白，特異性定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[6](endoplasmic reticulum，ER，也被稱為ERC-55)中，約由1900個(gè)堿基的mRNA編碼而成，參與細(xì)胞分化和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等作用。目前已知哺乳動(dòng)物體內(nèi)RCN有3種，研究發(fā)現(xiàn)，RCN-2在單純?nèi)橄侔┙M織中表達(dá)明顯升高[6]，在乳腺癌合并甲狀腺癌組織中表達(dá)下降[7]，這提示RCN2與甲狀腺癌相關(guān)，但是其在甲狀腺癌中表達(dá)作用研究較少。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)RCN2在甲狀腺乳頭狀癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況，并分析其異常表達(dá)的臨床意義，為甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供一定的理論依據(jù)，為臨床提供潛在的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料

收集2018年11月至2020年1月就診于國(guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院甲狀腺外科經(jīng)手術(shù)切除的65例甲狀腺乳頭狀腺癌組織和配對(duì)的癌旁組織(距離腫瘤≥1 cm)，然后立即將新鮮組織樣本儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱。入選標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)超聲、喉鏡、腫瘤標(biāo)志物、穿刺細(xì)胞學(xué)以及病理學(xué)檢查等確診為甲狀腺乳頭狀腺癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未經(jīng)放療和化療以及免疫治療；合并有其他惡性腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化等[8]疾病。手術(shù)前均告知患者并簽署知情同意書(shū)，并獲得本醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

患者包括<45歲者12例，≥45歲者53例；男22例，女43例，年齡26～73歲，平均年齡(47.55±10.96)歲；腫瘤直徑<1 cm者48例，≥1 cm者17例；腫瘤單發(fā)的有38例，多發(fā)的27例；病理分期Ⅰ～Ⅱ期者49例，Ⅲ～Ⅳ期者16例；頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者20例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者45例。

1.1.2 主要試劑

一抗：RCN2 Rabbit Polyclonal antibody，批號(hào)：10193-2-AP，100 μL；二抗：HRP-Goat Anti-rabbit IgG，批號(hào)：ANT020，50 μL；內(nèi)參：GAPDH Polyclonal Antibody，批號(hào)：YM3215，100 μg；ECL顯色試劑盒，批號(hào)：WBKLS100，100 mL均購(gòu)于安特捷生物技術(shù)有限公司。全蛋白提取試劑盒購(gòu)于凱基生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：KGP250，50tests；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)購(gòu)于上海翊圣生物科技有限公司，批號(hào)：20201ES76，500T；電泳儀型號(hào)：MINIVEPS2A200；凝膠成像系統(tǒng)型號(hào)：UPVINC。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色法

術(shù)中采集所有患者的部分甲狀腺癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本，在病理科醫(yī)生的配合下進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，具體操作如下：用濃度為10%的福爾馬林溶液固定標(biāo)本，經(jīng)脫水、石蠟包埋，將蠟塊標(biāo)本行3 μm厚度連續(xù)切片；烤片2 h，用二甲苯進(jìn)行2次變性，各5 min；將載玻片轉(zhuǎn)移至100%、95%、80%、60%的酒精和雙蒸水各5 min；將載玻片放置在裝有檸檬酸的容器中，進(jìn)行熱修復(fù)，后使其在室溫下冷卻；用PBS沖洗3個(gè)3 min，使用H2O2于室溫條件下孵育10 min；用PBS沖洗3個(gè)3 min；將一抗稀釋(濃度在1∶1000)滴加在載玻片上，4 ℃孵育過(guò)夜；用PBS沖洗3個(gè)3 min；加二抗(TBST稀釋，濃度1∶1000)后于常溫條件下孵育30 min；用PBS沖洗3個(gè)3 min，在室溫下用顯色劑(DAB)顯色8 min，用mayor’s蘇木素復(fù)染5 min，用清水沖洗2～3次；分別用60%、80%、95%、和100%的酒精脫水，封片。陰性對(duì)照為使用PBS溶液(濃度為0.01 mol/L)替代一抗，陽(yáng)性對(duì)照選用已知的陽(yáng)性標(biāo)本切片。

結(jié)果判斷:RCN2蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，免疫組化中以細(xì)胞質(zhì)黃染為陽(yáng)性。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分，由2位病理專業(yè)醫(yī)師進(jìn)行雙盲獨(dú)立評(píng)分，隨機(jī)觀察5個(gè)視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：0分，0～9%；1分，10%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，76%～100%。染色強(qiáng)度評(píng)分：0分，無(wú)染色；1分，淺黃色；2分，棕黃色；3分，深棕色。計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分與染色強(qiáng)度評(píng)分的乘積，最終免疫評(píng)分得分在0～12之間，總得分為4個(gè)等級(jí)：0為陰性(-)，1～4為弱陽(yáng)性(+)，5～8為陽(yáng)性(++)，9～12為強(qiáng)陽(yáng)性，根據(jù)免疫組織化學(xué)評(píng)分結(jié)果將患者分為高低表達(dá)兩組，其中≤4分為低表達(dá)，>4分為高表達(dá)組。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡法

術(shù)中采集所有患者的部分甲狀腺癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本，具體操作如下：取相同質(zhì)量的癌和癌旁組織，剪成碎末，按照全蛋白提取試劑盒的要求配液、混合、研磨，注意低溫操作，將組織勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5 mL預(yù)冷的離心管中，離心12 000 g，4 ℃離心5 min，取上清液即為全蛋白提取物。蛋白定量(Bradford法、BCA法)，分裝保存于-80 ℃，避免反復(fù)凍融。上樣前加入5× SDS上樣緩沖液，量為分裝蛋白樣品的1/4，混勻，100 ℃加熱5 min，冷卻后可放置冰上保存待用或放入-80 ℃保存。驗(yàn)漏、制膠、上樣，第1個(gè)槽加入5 μL marker用來(lái)指示蛋白條帶所對(duì)應(yīng)的分子量大小，隨后按照癌、癌旁的順序，每個(gè)槽的蛋白質(zhì)量保證在30 μg，電泳50 V、3 h左右，轉(zhuǎn)膜200 mA、1.5 h，轉(zhuǎn)膜后TBST洗2次，一次5 min，牛奶封閉1 h，封閉后加一抗和內(nèi)參GAPDH(2 μL的一抗配2 mL牛奶，0.4 μL內(nèi)參配2 mL牛奶)，4°過(guò)夜，TBST洗3次，每次10 min，孵二抗(1 μL二抗配10 mLTBST)，1 h后用TBST洗3次，分別10、10、15 min，ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像；通過(guò)Image J分析灰度值，并利用GraphPad Prism 8對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)染色法

65例甲狀腺乳頭狀癌患者中，RCN2蛋白在癌組織中的高表達(dá)率為69.23%(45/65)，明顯高于癌旁正常組織的18.46%(12/65)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=34.023，P<0.001)，RCN2使用免疫組織化學(xué)法在癌組織與癌旁組織中的典型表達(dá)，見(jiàn)圖1。

a.HE染色100倍顯微鏡下的癌組織；b.HE染色100倍顯微鏡下的癌旁組織；c.免疫組化200倍顯微鏡下的癌組織，以細(xì)胞質(zhì)黃染為陽(yáng)性；d.免疫組化200倍顯微鏡下的癌旁組織

2.2 蛋白質(zhì)印跡法

65例甲狀腺乳頭狀癌患者中，RCN2在癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織(RCN2的分子量是55KD，GAPDH的分子量是36KD)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=27.665，P<0.001)，見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 RCN2蛋白表達(dá)條帶

圖3 RCN2蛋白的灰度比值

2.3 RCN2表達(dá)與PTC臨床病理因素

RCN2表達(dá)與PTC臨床病理因素之間的聯(lián)系，見(jiàn)表1。

表1 RCN2表達(dá)與PTC臨床病理因素之間的聯(lián)系

3 討 論

近些年來(lái)，隨著醫(yī)療水平的提高，人們對(duì)體檢越來(lái)越重視，高分辨率超聲(US)的運(yùn)用使得甲狀腺結(jié)節(jié)的隨機(jī)檢出率高達(dá)76%[9]。資料顯示惡性結(jié)節(jié)超聲體征：縱橫比A/T>1，形態(tài)不規(guī)則，邊界不清，無(wú)聲暈，內(nèi)部回聲較復(fù)雜，微鈣化，中央型血流分布[10]，且病理結(jié)果也證實(shí)甲狀腺癌居多，其中PTC的比例最大。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年全球新增甲狀腺癌病例567 233例[11]，雖然PTC預(yù)后和總生存時(shí)間明顯得到改善[12]。但仍然有部分患者因病灶較小且隱匿，很難在早期被發(fā)現(xiàn)，常出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移致總體生存率較低[13]。因此探索PTC發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找新的生物靶標(biāo)尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，作為同一家族RCN中的RCN1蛋白，在結(jié)直腸癌[14]、乳腺癌[15]中均高表達(dá)，調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展，有望成為其潛在的生物標(biāo)志物；RCN3蛋白在肺癌發(fā)生、侵襲調(diào)控中也扮演了重要角色，可作為肺癌的生物標(biāo)記物[16]。RCN2是與鈣離子結(jié)合的蛋白，存在于細(xì)胞內(nèi)液中，參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[17]，在PTC中表達(dá)情況怎樣，是否參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，與患者病理特點(diǎn)之間的關(guān)系如何，能否成為調(diào)控甲狀腺乳頭狀癌生物學(xué)行為的關(guān)鍵蛋白和治療靶點(diǎn)，是本研究的主要目的。

本研究結(jié)果顯示，在甲狀腺乳頭狀癌組織中RCN2蛋白的表達(dá)水平高于癌旁組織，提示在癌細(xì)胞中RCN2存在異常表達(dá)，且這種高表達(dá)可能與疾病的發(fā)生、發(fā)展存在著某種因果聯(lián)系。研究也發(fā)現(xiàn)，RCN2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，是EGFR-ERK信號(hào)通路正向調(diào)控因子，與PEAK1協(xié)同通過(guò)激活EGFR-ERK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)結(jié)直腸癌侵襲遷移[18]；肝細(xì)胞癌的研究中也發(fā)現(xiàn)其在癌組織中的表達(dá)明顯增加，在信號(hào)機(jī)制上，RCN2與表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)相互作用，通過(guò)調(diào)節(jié)EGFR-ERK通路來(lái)激活肝癌的生長(zhǎng)與侵襲[19]。由此推測(cè)，RCN2可能通過(guò)調(diào)節(jié)EGFR-ERK通路潛在地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)，介導(dǎo)腫瘤的進(jìn)展。

病理特征相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，病人年齡≥45歲，腫瘤直徑≥1 cm，和腫瘤數(shù)量≥2個(gè)、臨床分期Ⅲ和Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者癌組織中RCN2表達(dá)水平也越高，表明了RCN2與甲狀腺腫瘤惡化進(jìn)展程度的正相關(guān)性。美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)將年齡>45歲作為甲狀腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素[20]。按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟提出的TNM分期法，淋巴轉(zhuǎn)移，TNMⅢ、Ⅳ期預(yù)后較差；多灶性甲狀腺癌也被稱為不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素[21]。此外，已報(bào)道結(jié)直腸癌中RCN2蛋白陽(yáng)性表達(dá)也提示預(yù)后較差[18]2299-2303，由此推測(cè)RCN2 可能促進(jìn)了腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移，影響著患者的預(yù)后，可成為甲狀腺惡性腫瘤的診斷與預(yù)后評(píng)判遴選的指標(biāo)之一。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)RCN2在甲狀腺乳頭狀癌組織中表達(dá)較癌旁明顯升高，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后密切相關(guān)，其可為甲狀腺乳頭狀癌的生物學(xué)標(biāo)志以及潛在治療靶點(diǎn)提供科學(xué)依據(jù)，但單一標(biāo)志物無(wú)法對(duì)甲狀腺癌的診斷和預(yù)后做出準(zhǔn)確判斷，臨床醫(yī)師在甲狀腺癌診斷、及預(yù)后評(píng)估中需全方位考慮。本實(shí)驗(yàn)不足之處在于研究對(duì)象數(shù)量相對(duì)不足，病理特征相關(guān)因素、數(shù)據(jù)相對(duì)較少，未跟蹤患者預(yù)后，這些在后期將繼續(xù)研究。