楊寧寧，董渠龍，焦立媛

大氣顆粒物中空氣動力學直徑≤2.5μm的細顆粒物（fine particulate matter，PM2.5）是一種粒徑小、面積大、活性強、成分復雜的環(huán)境污染物，其不僅可以吸附多種有毒有害物質(zhì)，還能在大氣中長時間停留及遠距離輸送，對人類健康存在嚴重威脅[1-2]，包括引起癌癥[3]、呼吸系統(tǒng)疾病[4]、心血管疾病[5]、免疫系統(tǒng)功能障礙[6]、神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙[7]及生殖系統(tǒng)損害[8-9]。在生殖損害方面，筆者所在課題組的前期研究已經(jīng)證實PM2.5在體外可以抑制人絨毛膜外滋養(yǎng)細胞的增殖及侵襲力，從而破壞滋養(yǎng)細胞的正常功能[10]，這與Wang等[11]的研究結(jié)果相一致。而滋養(yǎng)細胞被認為是維持妊娠的“核心元素”[12]，其功能受損則與不良妊娠結(jié)局息息相關(guān)，因此以人早孕胎盤絨毛膜外滋養(yǎng)層（human trophoblast HTR-8/SVneo，HTR）細胞為載體研究PM2.5的生殖毒性具有重要意義。

筆者所在課題組的前期研究通過反復實驗論證，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一定濃度的PM2.5對HTR細胞具有毒性作用，尤其150μg/mL濃度的PM2.5作用HTR細胞36 h后其細胞增殖抑制率達到21.97%，同時也發(fā)現(xiàn)一定濃度的五味子乙素（Schisandrin B，Sch B）可以降低PM2.5對HTR細胞的毒性作用，且在0.1～2μmol/L濃度范圍內(nèi)降低PM2.5所致細胞毒性的能力隨著Sch B濃度增加而增大，但潛在機制并不明確[13]。傳統(tǒng)中藥五子衍宗丸可以提高人類的生育力，Sch B是其君藥五味子的主要成份。研究表明，Sch B可以降低氧化應激反應并抑制細胞的凋亡[14]。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一種重要的抗氧化酶，前期研究也已證實Sch B可以激活SOD基因以降低苯并(a)芘所致的HTR細胞毒性[15]，故推測SOD基因在Sch B降低PM2.5所致的HTR細胞毒性的過程中也發(fā)揮著重要作用。

本研究在前期研究的基礎上，利用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）轉(zhuǎn)染技術(shù)干擾SOD mRNA表達，進一步利用多種實驗方法從細胞增殖、SODmRNA表達、SOD蛋白表達層面上探討SOD基因是否參與Sch B降低PM2.5損傷HTR細胞的過程，對于進一步闡明Sch B保護人類生殖能力的作用機制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料HTR細胞株由加拿大Graham教授惠贈，PM2.5（中國藥品生物制品檢定所），Sch B（中國藥品生物制品檢定所），RPMI-1640培養(yǎng)基（美國GIBCO公司），MTS細胞增殖檢測試劑盒（Promega北京生物技術(shù)有限公司），SOD siRNA轉(zhuǎn)染試劑（美國Santa Cruz生物技術(shù)公司），實時聚合酶鏈反應（real-time PCR）試劑盒（北京全式金生物公司），SOD酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（上海藍基生物科技有限公司），細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司），無菌超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)公司），Imark酶標儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)HTR細胞接種于規(guī)格為10 cm的細胞培養(yǎng)皿中，給予RPMI-1640完全培養(yǎng)基7 mL后置于37℃、含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h。根據(jù)細胞生長情況適時進行換液、傳代及SODsiRNA轉(zhuǎn)染、MTS細胞增殖實驗、real-time PCR和SODELISA實驗。

1.3 SOD基因干擾對HTR細胞進行SODsiRNA轉(zhuǎn)染以干擾SOD基因的表達，實驗方法按照Santa Cruz公司提供的試劑說明書進行，分為對照組、非特異序列轉(zhuǎn)染組（陰性對照組）及0.25、0.5、1μg SODsiRNA轉(zhuǎn)染組，利用real-time PCR檢測各組SODmRNA的表達情況，計算干擾效率。

1.4 MTS細胞增殖實驗收集消化的HTR細胞制成單細胞懸浮溶液，將HTR細胞接種于96孔板中（每孔接種10 000個細胞），分為6組，分別為對照組、PM2.5組、0.25μmol/L Sch B組、0.5μmol/LSch B組、1μmol/L Sch B組和2μmol/LSch B組，每組5個孔，培養(yǎng)24 h后添加作用試劑，其中對照組無Sch B和PM2.5作用，其余各組作用試劑分別為150μg/mL PM2.5、0.25 μmol/L Sch B+150μg/mL PM2.5、0.5μmol/L Sch B+150μg/mL PM2.5、1μmol/L Sch B+150μg/mL PM2.5和2μmol/L Sch B+150μg/mL PM2.5，繼續(xù)培養(yǎng)36 h后，利用酶標儀在492 nm波長處測出每孔的OD值。

將HTR細胞進行0.5μg SODsiRNA轉(zhuǎn)染，然后重復該實驗，以分析SODsiRNA轉(zhuǎn)染后各組HTR細胞的增殖情況。計算公式如下：各組增殖率=各組平均OD值÷對照組平均OD值×100%；抑制率=（對照組增殖率－實驗組增殖率）÷對照組增殖率×100%；保護率=（實驗組增殖率－PM2.5組增殖率）÷PM2.5組增殖率×100%。

1.5 Real-time PCR實驗對HTR細胞在SOD siRNA轉(zhuǎn)染前后均進行SODmRNA表達量分析，實驗分組同1.4部分，實驗步驟按照北京全式金生物公司提供的real-time PCR試劑盒說明書進行。其中SOD引物上游序列為5′-GCCGATGTGTCTATTGAAGATTC-3′，下游序列為5′-AGCAGGATAACAGATGAGTTAAGG-3′，擴增產(chǎn)物長度231 bp，擴增條件為95℃變性30 s，50℃退火34 s，72℃延伸45 s，共進行35次循環(huán)得到擴增產(chǎn)物。利用2-ΔΔCt計算公式得到各基因相對表達水平，其中以GAPDH作為內(nèi)源性參照。

1.6 SOD ELISA實驗對HTR細胞在SODsiRNA轉(zhuǎn)染前后進行SOD蛋白表達量分析，實驗分組同1.4部分，實驗步驟按照上海藍基生物科技有限公司提供的SODELISA試劑盒說明書進行，各組蛋白表達量以相對于對照組的倍數(shù)表示。

1.7 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。實驗中各數(shù)據(jù)均為定量資料，以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SOD siRNA轉(zhuǎn)染前各組對HTR細胞的增殖作用在SOD siRNA轉(zhuǎn)染前，PM2.5組及0.25、0.5、1、2 μmol/L Sch B組的細胞增殖率分別為對照組的78.03%、80.17%、84.20%、86.07%、89.01%。以此得出，與PM2.5組相比，0.25、0.5、1和2μmol/L Sch B組對HTR細胞的保護率分別為2.74%、7.91%、10.31%、14.07%，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），見圖1。

圖1 SODsiRNA轉(zhuǎn)染前Sch B及PM2.5對HTR細胞增殖的影響

2.2 SOD siRNA轉(zhuǎn)染HTR細胞以及干擾效率分析各濃度SOD siRNA轉(zhuǎn)染HTR細胞后，與對照組相比，陰性對照組（即轉(zhuǎn)染非特異序列組）的SOD mRNA表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而0.25、0.5、1.0μg SOD siRNA轉(zhuǎn)染組的SOD mRNA表達量分別是對照組的86.83%、64.86%、38.16%，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。鑒于0.5μg SODsiRNA干擾效率為35.14%，比例適中，后續(xù)實驗均以此劑量作為SOD基因干擾劑量，見圖2。

圖2 不同濃度SODsiRNA轉(zhuǎn)染后SODmRNA表達情況

2.3 SOD siRNA轉(zhuǎn)染后PM 2.5及各Sch B組對HTR細胞增殖的作用對HTR細胞進行SODsiRNA轉(zhuǎn)染后，再次利用MTS細胞增殖實驗測定各組細胞的增殖情況。其中，PM2.5組及0.25、0.5、1、2μmol/L Sch B組細胞增殖率分別降低為對照組的66.03%、66.95%、69.32%、71.15%、72.34%。其中，與PM2.5組相比，0.5、1、2μmol/L Sch B組細胞增殖率差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），0.25μmol/L Sch B組細胞增殖率差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見圖3。進一步分析SODsiRNA轉(zhuǎn)染后各濃度Sch B對HTR細胞的保護率，分別為1.39%、4.98%、7.75%和9.55。且PM2.5組與0.5、1、2 mol/LSchB組相比，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），而與0.25 mol/L SchB組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖4。

圖3 SOD siRNA轉(zhuǎn)染后各組HTR細胞的增殖情況

圖4 SODsiRNA轉(zhuǎn)染前后Sch B對HTR細胞的保護情況比較

2.4 SOD siRNA轉(zhuǎn)染前后各組SOD mRNA的表達情況利用real-time PCR測定SOD siRNA轉(zhuǎn)染前后各組SODmRNA的表達情況。在SOD siRNA轉(zhuǎn)染前，PM2.5組及0.25、0.5、1、2μmol/L Sch B組的SOD mRNA表達量分別是對照組的1.11、1.26、1.47、1.86、2.25倍，與對照組相比，各組差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；在SODsiRNA轉(zhuǎn)染后，PM2.5組及0.25、0.5、1、2μmol/LSch B組的SODmRNA表達量分別降至對照組的1.05、1.13、1.25、1.43、1.77倍，與對照組相比，PM2.5組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），其余各組差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），見圖5。

圖5 SOD siRNA轉(zhuǎn)染前后各組SOD mRNA相對于對照組的表達情況

2.5 SOD siRNA轉(zhuǎn)染前后各組SOD蛋白的表達情況利用ELISA測定在SOD siRNA轉(zhuǎn)染前后各組SOD蛋白的表達情況。在SODsiRNA轉(zhuǎn)染前，PM2.5組及0.25、0.5、1、2μmol/L Sch B組的SOD蛋白表達量分別是對照組的1.09、1.19、1.36、1.60、1.94倍，與對照組相比，各組差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；而在SOD siRNA轉(zhuǎn)染后，PM2.5組及0.25、0.5、1、2μmol/L Sch B組的SOD蛋白表達量分別降至對照組的1.04、1.09、1.16、1.27、1.41倍，與對照組相比，PM2.5組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），其余各組差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），見圖6。

圖6 SOD siRNA轉(zhuǎn)染前后各組SOD蛋白相對于對照組的表達情況

3 討論

關(guān)于PM2.5對人類生殖系統(tǒng)的危害已成共識，相關(guān)報道指出PM2.5與早產(chǎn)、流產(chǎn)、胎兒生長受限、妊娠期高血壓疾病、妊娠期糖尿病、出生缺陷及新生兒低出生體質(zhì)量等不良妊娠結(jié)局密切相關(guān)[16-17]。其中滋養(yǎng)細胞的受累尤為重要，而現(xiàn)有的研究則證實了PM2.5對人類滋養(yǎng)細胞的直接毒性作用[10-11]。經(jīng)前期反復論證，筆者所在課題組發(fā)現(xiàn)Sch B可以降低PM2.5對HTR細胞的毒性作用[13]，本實驗在前期研究的基礎上猜想Sch B實現(xiàn)這一保護作用與SOD基因的表達相關(guān)，故本研究在細胞、基因和蛋白三個層面進行了相關(guān)印證。

本研究對HTR細胞進行SOD siRNA轉(zhuǎn)染，以達到SOD基因的表達受到人為干擾。實驗發(fā)現(xiàn)，陰性對照組與對照組的SODmRNA表達無差異，說明轉(zhuǎn)染技術(shù)本身并不會干擾SOD基因的表達，而0.25、0.5、1.0μg SODsiRNA轉(zhuǎn)染后，其SODmRNA表達分別下降至對照組的86.83%、64.86%、38.16%，干擾效果明顯，最終選擇0.5μg SOD siRNA用于后續(xù)HTR細胞轉(zhuǎn)染，因為其35.14%的干擾效率較為合適。

首先，在細胞層面上，本研究利用MTS細胞增殖實驗檢測各組在SODsiRNA轉(zhuǎn)染前后HTR細胞的增殖情況。在轉(zhuǎn)染前，PM2.5組及0.25、0.5、1、2μmol/L Sch B組的細胞增殖分別為對照組的78.03%、80.17%、84.20%、86.07%、89.01%，而在SODsiRNA轉(zhuǎn)染后，其細胞增殖率分別降至66.03%、66.95%、69.32%、71.15%、72.34%，說明SOD基因的干擾增加了PM2.5對HTR細胞的毒性作用，同時分析Sch B的保護作用，在SOD siRNA轉(zhuǎn)染前，0.25、0.5、1、2μmol/L Sch B組的細胞保護率分別為2.74%、7.91%、10.31%、14.07%，在SODsiRNA轉(zhuǎn)染后，其細胞保護率分別降至1.39%、4.98%、7.75%、9.55%，說明SOD基因的干擾降低了Sch B對HTR細胞的保護作用。這在細胞層面上證實SOD基因參與了Sch B降低PM2.5對HTR細胞毒性的過程中。

隨后，本研究采用real-time PCR實驗從基因?qū)用嫔先ビ∽CSOD基因在Sch B降低PM2.5對HTR細胞毒性中的作用。在SOD siRNA轉(zhuǎn)染前，PM2.5組及0.25、0.5、1、2μmol/L Sch B組的SOD mRNA分別是對照組的1.11、1.26、1.47、1.86、2.25倍，而在SOD siRNA轉(zhuǎn)染后，以上各組的SODmRNA表達量則分別降至對照組的1.05、1.13、1.25、1.43、1.77倍，除PM2.5組外，其余各組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。這說明無論SODsiRNA轉(zhuǎn)染前后，Sch B均可以激活SOD基因，且在實驗中的Sch B濃度范圍內(nèi)，其激活SOD基因的表達量與Sch B的濃度呈正相關(guān)，但是在SODsiRNA轉(zhuǎn)染后，Sch B激活SODmRNA的能力明顯下降。由此聯(lián)系MTS細胞增殖實驗的結(jié)果，不難發(fā)現(xiàn)，Sch B在不同劑量下激活SOD基因的能力與對HTR細胞的保護能力相一致，這在基因?qū)用嫔献C實，Sch B可以通過激活SOD基因降低PM2.5對HTR細胞毒性。

但是，有一個問題值得注意和探討，就是PM2.5作為HTR細胞毒性物質(zhì)在實驗中同樣也能輕微地激活SOD基因表達，通過查閱相關(guān)文獻，本文筆者分析這應該是PM2.5在對HTR細胞產(chǎn)時毒性時細胞啟動內(nèi)源性保護機制從而激活SOD基因表達所致，但這種內(nèi)源性保護方式僅是一種細胞應答，不能完全抵抗PM2.5的強致毒性，所以在細胞層面上仍表現(xiàn)為細胞損傷，而在基因?qū)用嫔峡梢詸z測到SODmRNA的高表達。

最后，本研究利用SODELISA實驗在蛋白層面驗證SOD在Sch B降低PM2.5對HTR細胞毒性中的作用。結(jié)果表明，在SOD siRNA轉(zhuǎn)染前，PM2.5組及0.25、0.5、1、2μmol/LSch B組的SOD蛋白表達量分別是對照組的1.09、1.19、1.36、1.60、1.94倍，而在SOD siRNA轉(zhuǎn)染后，以上各組的SOD蛋白表達量則分別降至對照組的1.04、1.09、1.16、1.27、1.41倍，除PM2.5組外，其余各組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。這說明無論SODsiRNA轉(zhuǎn)染前后，Sch B均可以增加SOD蛋白表達量，且在實驗中的Sch B濃度范圍內(nèi)，其增加SOD蛋白的表達量與Sch B的濃度呈正相關(guān)，但是在SODsiRNA轉(zhuǎn)染后，Sch B增加SOD蛋白表達量的能力明顯下降，這與各組轉(zhuǎn)染前后SOD mRNA的表達完全一致，所以在蛋白層面上也表明，Sch B可以通過增加SOD蛋白的表達量降低PM2.5對HTR細胞毒性。

綜上所述，本研究從細胞、基因和蛋白3個層面證實了SOD基因的高表達在Sch B降低PM2.5對HTR細胞的毒性作用中發(fā)揮了重要作用，這也許只是Sch B降低PM2.5所致HTR細胞損害的作用機制之一，但讓Sch B的保護人類生育力的作用途徑變得逐漸清晰，后續(xù)的研究仍需探討Sch B發(fā)揮保護作用的分子通路，以期能夠為改善人類生殖能力取得突破。