張夢(mèng)珂,崔小蝶,吳 華,羅行煒,劉建華,翟亞軍,賀丹丹,潘玉善,苑 麗,胡功政

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450002)

沙門菌(Salmonella)是常見(jiàn)的宿主范圍廣泛的人畜共患病原菌,具有高致病性和高死亡率[1,2]；目前已發(fā)現(xiàn)的沙門菌血清型已超過(guò)2600種,其中鼠傷寒沙門菌的感染率和發(fā)病率居沙門菌感染的首位,對(duì)公共健康和食品安全造成了嚴(yán)重的損害[3,4]。隨著抗生素的廣泛使用,食源性沙門菌的耐藥性急劇上升,更嚴(yán)重的是導(dǎo)致了多藥耐藥(Multidrug resistance, MDR)沙門菌的出現(xiàn)[5]。雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(Two-component signal transduction system, TCS)是細(xì)菌中普遍存在的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一,具有廣泛的調(diào)節(jié)功能,在細(xì)菌致病性和耐藥性方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[6,7]。CpxAR系統(tǒng)是在革蘭氏陰性菌中普遍存在的TCS,由跨膜的感應(yīng)子激酶CpxA和胞內(nèi)的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白CpxR組成,可調(diào)控多種細(xì)菌致病性和耐藥性的形成[8,9]。研究發(fā)現(xiàn)CpxAR對(duì)多種細(xì)菌的耐藥性及MDR有重要的調(diào)控作用,例如可調(diào)控沙門菌、大腸桿菌等對(duì)β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、陽(yáng)離子類抗菌肽、磷霉素等藥物的耐藥性[10-12]。外排泵系統(tǒng)是介導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生MDR的重要因素之一,外排泵活性的增加通常會(huì)增加細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的外排作用,其中AcrAB-tolC系統(tǒng)包括外膜通道蛋白TolC、內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AcrB和周質(zhì)蛋白融合蛋白AcrA,任何一個(gè)組分的缺陷都會(huì)導(dǎo)致外排功能的失活[13,14]。研究表明:抑制外排泵能逆轉(zhuǎn)多種細(xì)菌對(duì)多種抗菌藥物的耐藥性,其中RND家族的外排泵活性與大腸桿菌和沙門菌的MDR密切相關(guān)[15,16],而TolC作為RND家族的多個(gè)外排泵的公用外膜通道蛋白,可能成為消除或抑制MDR的作用靶點(diǎn)[17,18]。

CpxAR的調(diào)控作用與外排泵系統(tǒng)的活性密切相關(guān),在沒(méi)有TolC依賴性外排的情況下,細(xì)胞內(nèi)代謝物或信號(hào)分子蓄積,CpxAR系統(tǒng)被激活[19]。CpxAR能對(duì)某些代謝物產(chǎn)生反應(yīng),進(jìn)而激活CpxR,再上調(diào)AcrAB-TolC的表達(dá),從而調(diào)控對(duì)陽(yáng)離子抗菌肽-精蛋白的抗藥性[20]。迄今為止,TCS和外排泵系統(tǒng)之間的調(diào)控機(jī)制尚不明確,對(duì)TCS、外排泵和MDR之間的相互關(guān)系仍知之甚少。前期研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)鼠傷寒沙門菌的cpxR和acrB同時(shí)缺失時(shí),菌株對(duì)多西環(huán)素、慶大霉素、阿米卡星和頭孢噻呋的敏感性與單基因缺失株相比進(jìn)一步升高,但這僅是從acrB缺失時(shí)AcrAB-TolC外排泵與CpxAR系統(tǒng)之間的相互作用而言,而cpxR缺失與tolC缺失協(xié)同作用能引起哪些變化尚沒(méi)有研究報(bào)道。因此,本研究通過(guò)噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)同時(shí)敲除RND外排泵家族的通用外膜蛋白基因tolC與cpxR基因,分析了其對(duì)常用抗菌藥物的敏感性的變化,從JSΔcpxRΔtolC來(lái)觀察CpxAR與外排泵系統(tǒng)之間的協(xié)同作用關(guān)系,以期為尋找消除或抑制MDR的作用新靶點(diǎn)并深入分析兩者協(xié)同作用的分子機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌種(CVCC541,命名為JS)源自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,由本實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌ATCCR25922購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保存中心,作為質(zhì)控菌。pCP20質(zhì)粒、pBAD-HisA質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室保存;沙門菌噬菌體P22HT105/int由河南科技學(xué)院饋贈(zèng),本實(shí)驗(yàn)室保存。鼠傷寒沙門菌單基因缺失株JSΔcpxR和JSΔtolC::kan由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑和藥品

LB肉湯、LB瓊脂、MH肉湯等培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;質(zhì)粒小提試劑盒、DNA膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司;DL2000和DL5000 DNA Marker購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;卡那霉素(Kan)、氨芐青霉素(Amp)和L-阿拉伯糖均購(gòu)自Solarbio公司;環(huán)丙沙星、恩諾沙星、頭孢噻肟、痢菌凈、頭孢噻呋、頭孢喹肟、多西環(huán)素、土霉素、喹乙醇、氟苯尼考、頭孢曲松、阿米卡星均為國(guó)產(chǎn)原料藥,符合中國(guó)藥典或中國(guó)獸藥典質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),使用前置于4 ℃冰箱保存,使用時(shí)均在有效期之內(nèi)。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上已公布的鼠傷寒沙門菌的全基因組序列(HG326213.1),利用Primer 5.0設(shè)計(jì)tolC基因缺失鑒定引物：Tr-F為GCTTTACCTCGCCACTCATT；Tr-R為TGGGCGGTCACTTCATTC。根據(jù)黃慧等[21]的方法設(shè)計(jì)其他引物,其中Cr-F/Cr-R為cpxR基因缺失鑒定引物,Kr-F/Kr-R為kan基因鑒定引物,cpxR-F/cpxR-R為cpxR基因回補(bǔ)鑒定引物。各引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 cpxR和tolC雙基因缺失株的構(gòu)建

利用噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù),將本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建好的tolC缺失株JSΔtolC::kan(tolC基因被kan替代)作為供體菌,將cpxR缺失株JSΔcpxR作為受體菌,在P22噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用下,制備雙基因缺失株JSΔcpxRΔtolC::kan。

1.4.1 噬菌體的增殖 挑取JS單菌落，將其接種于10 mL LB肉湯培養(yǎng)基,在37 ℃下振蕩培養(yǎng)；當(dāng)濃度達(dá)到108CFU/mL時(shí),加入100 μL噬菌體原液,在37 ℃下靜置20 min,使噬菌體充分吸附細(xì)菌,再在37 ℃下振蕩培養(yǎng)5～8 h,可見(jiàn)菌液變澄清,說(shuō)明細(xì)菌被噬菌體裂解。然后加入100 μL氯仿,充分振蕩混勻,離心取上清液；最后用0.22 μm濾膜過(guò)濾,獲得較純的噬菌體,于4 ℃保存。

1.4.2 含有ΔtolC::kan片段的噬菌粒的制備 挑取JSΔtolC::kan單菌落，將其接種于10 mL LB肉湯培養(yǎng)基中,于37 ℃下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；然后加入適量的噬菌體增殖液,先在37 ℃下靜置20 min,再在37 ℃下振蕩培養(yǎng)5～8 h,獲得含有ΔtolC::kan片段的噬菌粒。

1.4.3 噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo) 挑取JSΔcpxR單菌落，將其接種于10 mL LB肉湯培養(yǎng)基中,在37 ℃下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；將10 μL含有ΔtolC::kan片段的噬菌粒與190 μL過(guò)夜培養(yǎng)的JSΔcpxR菌液混合,在室溫下靜置20 min；然后將其加入1 mL LB肉湯培養(yǎng)基,在37 ℃下振蕩培養(yǎng)30 min；離心收集細(xì)菌沉淀,用100 μL LB肉湯培養(yǎng)基懸浮,然后涂布于含卡那霉素(50 μg/mL)的LB瓊脂平板上,篩選JSΔcpxRΔtolC::kan陽(yáng)性菌。

1.4.4 轉(zhuǎn)導(dǎo)子的鑒定 挑取平板上的單菌落，將其接種于5 mL、含卡那霉素(50 μg/mL)的LB肉湯培養(yǎng)基中,在37 ℃下過(guò)夜培養(yǎng)；然后分別用鑒定引物Cr-F/Cr-R、Tr-F/Tr-R和Kr-F/Kr-R進(jìn)行PCR鑒定,同時(shí)將PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4.5kan基因的消除 將pCP20質(zhì)粒電轉(zhuǎn)導(dǎo)入JSΔcpxRΔtolC::kan中,涂布于含氨芐西林和卡那霉素的LB平板上，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,在30 ℃下培養(yǎng)過(guò)夜；將獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接于無(wú)抗性的LB液體培養(yǎng)基中,于42 ℃下培養(yǎng)數(shù)小時(shí)以消除pCP20質(zhì)粒；挑取單菌落，將其分別轉(zhuǎn)接于含氨芐西林、卡那霉素和無(wú)抗性的LB瓊脂板上,在37 ℃下培養(yǎng),獲得在氨芐西林和卡那霉素平板上均不生長(zhǎng)的突變株,說(shuō)明kan基因已被消除,獲得了雙基因缺失株JSΔcpxRΔtolC。

1.5 cpxR基因回補(bǔ)株的構(gòu)建

將前期構(gòu)建好的pBAD-cpxR重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)導(dǎo)入構(gòu)建的雙基因缺失株中,涂布于含氨芐西林的LB平板上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,用cpxR-F/cpxR-R進(jìn)行PCR鑒定,并對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序,構(gòu)建cpxR回補(bǔ)株JSΔcpxRΔtolC/pcpxR。

1.6 MIC值的測(cè)定

采用微量肉湯稀釋法測(cè)定12種常用抗菌藥物環(huán)丙沙星、恩諾沙星、頭孢噻肟、痢菌凈、頭孢噻呋、頭孢喹肟、多西環(huán)素、土霉素、喹乙醇、氟苯尼考、頭孢曲松、阿米卡星的最小抑菌濃度(MIC),質(zhì)控菌為大腸桿菌ATCCR25922,試驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 cpxR和tolC雙基因缺失株的構(gòu)建

2.1.1 JSΔcpxRΔtolC::kan轉(zhuǎn)導(dǎo)子的鑒定 將含有ΔtolC::kan片段的噬菌粒與受體菌JSΔcpxR混合培養(yǎng)后,在含卡那霉素的LB瓊脂平板上長(zhǎng)出轉(zhuǎn)導(dǎo)子,說(shuō)明噬菌粒已將ΔtolC::kan片段傳導(dǎo)給受體菌JSΔcpxR。挑取轉(zhuǎn)導(dǎo)子的單克隆,用引物Cr-F/Cr-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,發(fā)現(xiàn)在cpxR缺失前、后片段大小分別為854和190 bp(圖1A)；用Tr-F/Tr-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在tolC缺失前、后的片段大小分別為938和2060 bp(插入了kan基因),如圖1B所示；用Kr-F/Kr-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定kan基因，結(jié)果如圖1C所示。測(cè)序結(jié)果也證實(shí)篩選的轉(zhuǎn)導(dǎo)子為cpxR和tolC雙基因缺失株JSΔcpxRΔtolC::kan。

2.1.2kan基因消除的鑒定 將pCP20質(zhì)粒電轉(zhuǎn)導(dǎo)入JSΔcpxRΔtolC::kan中,涂布于含氨芐西林和卡那霉素的LB平板上，在30 ℃下培養(yǎng),獲得了陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；再在42 ℃下培養(yǎng)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，消除pCP20質(zhì)粒,獲得了在氨芐西林和卡那霉素平板上均不生長(zhǎng)的突變株,獲得了kan基因被消除的雙基因缺失株JSΔcpxRΔtolC。經(jīng)PCR擴(kuò)增,證實(shí)kan已被消除(圖2)。測(cè)序結(jié)果證明cpxR和tolC雙基因缺失株構(gòu)建成功。

2.2 cpxR回補(bǔ)株的構(gòu)建

將前期構(gòu)建好的pBAD-cpxR重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)導(dǎo)入構(gòu)建的JSΔcpxRΔtolC中,涂布于含氨芐西林的LB平板上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,經(jīng)PCR鑒定,得到了714 bp的目的片段；對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定,得到了4100 bp的載體條帶和714 bp的目的條帶,與預(yù)期結(jié)果一致；同時(shí)測(cè)序結(jié)果正確,說(shuō)明回補(bǔ)株JSΔcpxRΔtolC/pcpxR構(gòu)建成功(圖3)。

A：引物Cr-F/Cr-R的擴(kuò)增產(chǎn)物; B:引物Tr-F/Tr-R的擴(kuò)增產(chǎn)物; C:引物Kr-F/Kr-R的擴(kuò)增產(chǎn)物; M:DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1:JSΔcpxRΔtolC::kan; 2:JSΔcpxR; 3:JSΔtolC::kan; 4:JS; 5:陰性對(duì)照。

A：引物Cr-F/Cr-R的擴(kuò)增產(chǎn)物; B:引物Tr-F/Tr-R的擴(kuò)增產(chǎn)物; C:引物Kr-F/Kr-R的擴(kuò)增產(chǎn)物; M:DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1:JSΔcpxRΔtolC; 2:JSΔcpxRΔtolC::kan; 3:JSΔcpxR; 4:JSΔtolC::kan; 5:JS; 6:陰性對(duì)照。

A：引物cpxR-F/cpxR-R的擴(kuò)增產(chǎn)物; B:雙酶切鑒定JSΔcpxRΔtolC/pcpxR; M:DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1～3:JSΔcpxRΔtolC/pcpxR; 4:JS; 5:陰性對(duì)照; 6:質(zhì)粒雙酶切鑒定; 7:PCR鑒定。

2.3 MIC值的測(cè)定

MIC測(cè)定結(jié)果(表1)顯示：與標(biāo)準(zhǔn)株JS相比,cpxR缺失株對(duì)大部分藥物(環(huán)丙沙星、恩諾沙星、多西環(huán)素、土霉素、痢菌凈、喹乙醇、頭孢噻呋、氟苯尼考、頭孢曲松)的MIC值保持不變,僅頭孢噻肟、頭孢喹肟和阿米卡星的MIC值降低至1/2;tolC缺失株對(duì)頭孢曲松的MIC值保持不變,對(duì)其余11種抗菌藥物(環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、頭孢喹肟、多西環(huán)素、痢菌凈、喹乙醇、頭孢噻呋、氟苯尼考、土霉素、恩諾沙星、阿米卡星)的MIC值分別降低至JS的1/8、1/2、1/4、1/8、1/8、1/2、1/16、1/4、1/4、1/8、1/2;cpxR和tolC雙基因缺失株對(duì)環(huán)丙沙星、頭孢噻呋、氟苯尼考、土霉素、頭孢曲松、阿米卡星的MIC值變化與tolC缺失株保持一致,而對(duì)頭孢噻肟、頭孢喹肟、多西環(huán)素、痢菌凈、喹乙醇、恩諾沙星的MIC均又進(jìn)一步降低至1/2;將cpxR回補(bǔ)到JSΔcpxRΔtolC中后,對(duì)環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、頭孢噻呋、喹乙醇的MIC值升高至JSΔcpxRΔtolC的2倍,對(duì)恩諾沙星的MIC升高至4倍,對(duì)頭孢喹肟的MIC升高至8倍。

3 討論

噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)是利用噬菌體的吞噬、裂解和釋放的功能來(lái)完成兩個(gè)細(xì)胞之間遺傳性狀傳遞的一種技術(shù)。隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展,噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)已成為基因精細(xì)結(jié)構(gòu)分析的常用方法,也是基因工程中常用的一種構(gòu)建基因缺失株的方法[21]。在本試驗(yàn)中,以前期構(gòu)建的JSΔtolC::kan為供體菌(△tolC::kan含有兩端帶有同源臂的1607 bp的kan序列),以JSΔcpxR為受體菌,利用P22噬菌體作為轉(zhuǎn)導(dǎo)媒介，將tolC失活片段轉(zhuǎn)移給cpxR缺失株,從而獲得了攜帶kan基因的雙基因缺失株JSΔcpxRΔtolC::kan。pCP20質(zhì)粒是FLP重組酶的表達(dá)質(zhì)粒,為溫度敏感型復(fù)制子,在42 ℃條件下可誘導(dǎo)FLP重組酶的表達(dá),質(zhì)粒也隨之逐漸丟失,在基因敲除的過(guò)程中用于消除FRT位點(diǎn)間的kan基因,從而最終得到雙基因缺失株JSΔcpxRΔtolC。

表1 雙基因缺失株對(duì)12種臨床常用代表性藥物的敏感性檢測(cè)結(jié)果(MIC) μg/mL

在本試驗(yàn)中,與鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株JS相比,cpxR缺失株對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物的敏感性增強(qiáng),這是由于CpxA通過(guò)調(diào)節(jié)OmpF和AcrD的表達(dá),以CpxR依賴性方式調(diào)控了腸桿菌科對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥性[10]。多重耐藥泵AcrAB-tolC具有廣泛的底物,包括氟喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類和氨基糖苷類等,前期研究發(fā)現(xiàn)在acrB缺失后,對(duì)β-內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類藥物的敏感性均增強(qiáng)；而本研究發(fā)現(xiàn)tolC缺失后不僅對(duì)β-內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類的敏感性增強(qiáng),而且對(duì)四環(huán)素類、喹噁啉類藥物的敏感性也顯著增強(qiáng),這與tolC缺失后其它幾個(gè)依賴TolC的RND外排泵的功能失活有關(guān)。Sulavik M C等發(fā)現(xiàn)：acrAB的缺失導(dǎo)致大腸桿菌對(duì)35種化合物中25種的敏感性增加；而tolC的缺失導(dǎo)致大腸桿菌對(duì)其中幾種化合物的敏感性較缺失acrAB的菌株進(jìn)一步升高[22],表明細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性是多個(gè)外排泵系統(tǒng)共同作用的結(jié)果。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)cpxR和tolC同時(shí)缺失時(shí),菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、喹噁啉類藥物的敏感性進(jìn)一步升高,但對(duì)頭孢噻呋、頭孢曲松和土霉素的敏感性未發(fā)生變化,這可能是因?yàn)镸DR的調(diào)控機(jī)制是復(fù)雜多樣的,且不同藥物的調(diào)控靶點(diǎn)和途徑也不盡相同,即使是同一個(gè)外排泵或外膜蛋白對(duì)同一類不同種藥物的外排能力和滲透能力也存在差別。而在cpxR回補(bǔ)后,對(duì)頭孢噻肟、頭孢噻呋、頭孢喹肟的敏感性有所降低,證實(shí)了CpxAR可調(diào)控鼠傷寒沙門菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥性。

Taylor等研究發(fā)現(xiàn): CpxAR的激活可上調(diào)霍亂弧菌RND多藥外排系統(tǒng)VexAB和VexGH相關(guān)基因的表達(dá),而VexAB和VexGH的缺失滅活可激活CpxAR系統(tǒng),兩者存在相互調(diào)控的關(guān)系[23]。劉雪玲等通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，與WT菌株相比,ΔtolC中存在大量的基因上調(diào)表達(dá),主要包括外排泵相關(guān)基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子以及CpxAR雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)中存在于周質(zhì)間隙的輔助調(diào)節(jié)蛋白CpxP等[24]。相關(guān)研究證實(shí)大腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類的耐藥性主要受5種RND家族的外排系統(tǒng)(AcrAB、AcrD、AcrEF、MdtABC和MdtEF)的協(xié)調(diào)調(diào)控[25]； Hu等的研究表明CpxR可調(diào)控沙門菌外膜蛋白和外排泵的表達(dá)量[26]。TolC既是外排泵AcrAB不可或缺的部分,也為RND家族另4個(gè)外排泵(AcrAD、AcrEF、MdtEF和MdtABC)完成功能所必需；依賴TolC的系統(tǒng)是毒力蛋白和抗菌藥物普遍存在的排出路徑,且它們的保守結(jié)構(gòu)可能成為多藥耐藥病原體抑制劑的靶點(diǎn)[17]。然而, CpxAR與AcrAB-tolC協(xié)同調(diào)控MDR的深層次機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株JS的cpxR和tolC雙基因缺失株及cpxR回補(bǔ)株JSΔcpxRΔtolC/pcpxR。cpxR和tolC缺失的協(xié)同作用調(diào)控菌株對(duì)頭孢噻肟、頭孢喹肟、多西環(huán)素、痢菌凈、喹乙醇、恩諾沙星的敏感性。