翟亞芳，劉賢德，，呂 東，趙 明，趙 祜，趙興鵬，王藝林，趙玉紅

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學 林學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省祁連山水源涵養(yǎng)林研究院，甘肅 張掖 734000）

韃靼忍冬Lonicera tatarica又名新疆忍冬、桃色忍冬，為忍冬科Caprifoliaceae忍冬屬LoniceraLinn 落葉灌木，原產(chǎn)于歐洲及西伯利亞[1]，我國陜西、寧夏等地均有分布[2]。韃靼忍冬抗逆性強，為西北干旱半干旱區(qū)地區(qū)重要的園林觀賞植物之一，應(yīng)用前景廣闊。

相關(guān)學者對忍冬科植物的研究大多停留在形態(tài)特征與系統(tǒng)分類、藥用價值、解剖學和引種適應(yīng)性等角度[3-8]，有少數(shù)學者對韃靼忍冬進行了扦插繁殖技術(shù)的研究[9-11]，但鮮有關(guān)于抗氧化酶對韃靼忍冬插穗生根影響的研究報道。在扦插生根過程中，扦插穗條不定根的形成和芽的分化時期[12]，插穗內(nèi)部會發(fā)生一系列生理變化，在這個過程中，植物生長調(diào)節(jié)劑對植物扦插生根發(fā)揮著重要作用，生長調(diào)節(jié)劑起著調(diào)節(jié)激素間平衡和促進內(nèi)源激素合成的作用。有研究表明:萘乙酸（NAA）和吲哚丁酸（IBA）均可促進紅纓海棠插穗愈傷組織生根，而NAA 處理可促進插穗皮部生根[13]，同時在生根過程中過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和超氧化物歧化酶（SOD）發(fā)揮著重要的作用[14-18]。

本試驗采用3因素3水平 L9(33) 正交試驗設(shè)計，以3 種生長調(diào)節(jié)劑萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）和吲哚乙酸（IAA）處理韃靼忍冬扦插穗條，進行扦插繁殖試驗，分析不同植物生長調(diào)節(jié)劑處理對韃靼忍冬扦插生根的影響，以期篩選出促進韃靼忍冬插穗生根的最優(yōu)生長調(diào)節(jié)劑處理組合，同時明晰扦插生根過程中POD、PPO 和SOD 活性的變化對生根指標的影響，為西北干旱半干旱區(qū)韃靼忍冬扦插快繁提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于甘肅省張掖市龍渠種子園（38°48′41″N、100°13′42″E，海拔1 700 m）年平均氣溫6.8℃，極端最高氣溫33.4℃，極端最低氣溫-26.5℃；年降水量193.0 mm，年蒸發(fā)量1 653.0 mm，相對濕度51%，無霜期152 d，日照時數(shù)2 435.6 h。扦插環(huán)境為基地內(nèi)日光溫室。

1.2 材 料

韃靼忍冬嫩枝采自于良種基地內(nèi)韃靼忍冬引種區(qū)。2020年7月上旬，從韃靼忍冬采穗母樹上采集健壯、無有害生物的當年生嫩枝，采后及時放入盛水的水桶內(nèi)，將采回的枝條剪成成長5～8 cm 的插穗，上下切口均平切，頂端保留2 側(cè)芽和2 片完整的葉片，每50 支為1 捆。插穗處理所用生長調(diào)節(jié)劑為萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）和吲哚乙酸（IAA）（上海山浦化工有限公司生產(chǎn)）；插穗消毒藥劑為50%多菌靈殺菌劑（山西德威本草生物科技有限公司）。

1.3 試驗方法

采用L9(33)正交試驗設(shè)計，設(shè)植物生長調(diào)節(jié)劑種類、質(zhì)量濃度及處理時間3 個因素，每個因素3個水平（表1），以清水為對照，共10 個處理（表2）。田間試驗采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，每個處理進行3 次重復(fù)，共 30 個區(qū)組，每個區(qū)組扦插50 根，共扦插1 500 根。

表1 韃靼忍冬扦插正交試驗因素和水平Table 1 Orthogonal experimental design levels of plant growth regulators on Lonicera tatarica cuttings

表2 韃靼忍冬正交試驗設(shè)計Table 2 Orthogonal experimental design of plant growth regulators on Lonicera tatarica cuttings

1.4 扦插及其插后管理

扦插前將蛭石、泥炭土和珍珠巖按1∶2∶1 的比例均勻混合后配成扦插基質(zhì)，用育苗穴盤（50穴）填裝基質(zhì)。按照3 盤為一組擺于溫室大棚內(nèi)。扦插前1 天用50%多菌靈溶液對扦插基質(zhì)噴淋消毒；扦插前將基質(zhì)澆透水后，用木棍在基質(zhì)上打4～6 cm 深的扦插孔，扦插后用手壓實插穗周邊基質(zhì)并噴淋清水。扦插后前5 d，每隔1 h 對插穗噴水1 次，每次3 min，使插穗葉面保持水霧狀態(tài)。扦插5 d 后，每天早晨、中午和傍晚噴水1 次，每次20 min。扦插后前7 d，每隔2 d 用50%多菌靈溶液噴灑消毒，隨后每隔1 周消毒1 次。及時清理插床上的枯落葉、壞死插穗、雜草；每天記錄扦插大棚內(nèi)的溫、濕度，使溫度保持25～28℃。

1.5 調(diào)查及指標測定方法

1.5.1 插穗形態(tài)觀察及生長指標的測定

扦插后，每隔3 d 隨機抽樣1 次，觀察插穗切口膨大、愈傷組織和不定根形成情況；扦插15 d 后，隨機抽樣觀察插穗基部膨大情況，每隔10 天調(diào)查1 次，并對生根形態(tài)拍照記錄；扦插55 d 后，調(diào)查統(tǒng)計不同生長調(diào)節(jié)劑處理插穗的生根數(shù)量、生根率、平均根數(shù)、平均根長、最長根長、最小根長，計算根系效果指數(shù)。根系效果指數(shù)=平均根長×平均根數(shù)/插穗總數(shù)[15]；生根率（%）=生根株數(shù)/扦插總數(shù)×100%[19]；平均根數(shù)（條）=插穗生根數(shù)量總和/生根插穗數(shù)量總和[19]；平均根長（cm）=插穗生根長度總和/插條生根數(shù)量總和[19]。

1.5.2 酶活性測定

插穗基部開始膨大時（15 d），進行插穗生理指標POD 酶、PPO 酶、SOD 酶的活性測定。插穗基部膨大后每隔10 d 取樣1 次，共5 次。每個處理每次隨機抽取5 個插穗，重復(fù)3 次。取樣后，帶入實驗室用清水處理干凈插穗根部以及葉面，用吸水紙吸干水分，用錫紙進行包裝記錄，裝入密封袋中，儲存于-80℃的低溫冰箱中，等待生理指標的檢測。POD 活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[20]；PPO 活性測定采用鄰苯二酚比色法[21]；超氧化物歧化酶SOD 活性采用NBT（氮藍四唑）光還原法測定[22]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計和圖表繪制采用Excel 2016，數(shù)據(jù)分析用SPSS 20.0，用Duncan’s 進行顯著性差異和多重比較分析，采用隸屬函數(shù)法[23]對各處理生根效果進行綜合評價式中，X為9 個處理中各指標測定值，Xmin和Xmax為某一指標在9 個處理中的最小值和最大值。

2 結(jié)果分析

2.1 韃靼忍冬插條生根進程

插后每隔3 d 隨機抽樣觀察插穗生根情況。10～15 d 時有少部分插穗皮孔外凸、開裂（圖1A），也有一部分插穗在韌皮部與木質(zhì)部夾層開始形成愈傷組織（圖1B）；20～25 d 時不定根開始從愈傷組織處（圖1D）或皮孔開裂處（圖1E）生出，愈傷組織膨大數(shù)量增多，形成愈傷組織的插穗數(shù)量持續(xù)增加（圖1C）；30～35 d 時不定根繼續(xù)伸長，插穗上帶的葉片色澤變暗淡，部分插穗上的葉片開始發(fā)黃脫落，新葉完全展開（圖1F）；40～45 d，愈傷組織停止生長，部分插穗愈傷組織開始褐變，不定根快速生長，根系不斷伸長增粗，并出現(xiàn)了二級根（圖1G—H），少部分插穗開始有開花現(xiàn)象（圖1I）；55 d 后，插穗生成完整的根系（圖1J）。綜合分析生根進程，可將插穗不定根的形成大致劃分為4 個階段：1）不定根原基誘導(dǎo)及發(fā)生皮裂階段；2）不定根表達、形成階段；3）不定根伸長及發(fā)育階段；4）不定根快速生長、增粗階段。統(tǒng)計生根類型發(fā)現(xiàn)，有80%左右的插穗以皮部生根為主，少部分為愈傷組織生根類型。

圖1 韃靼忍冬扦插生根過程中不同階段插穗的情況Fig.1 Rooting development properties of Lonicera tatarica in different cutting stages

2.2 不同處理對韃靼忍冬插穗生根指標的影響

由表3可知，不同濃度、不同處理時間的生長調(diào)節(jié)劑對插穗各項生根指標存在顯著性差異（P＜0.05）。生根率以T4 最高，為85.67%，其次是T6為79.33%；T2 和T3 最低，分別為20.53%和20%；除T2 和T3 外，其余處理的生根率均大于CK。平均根數(shù)以T6 最多（21.83 條）；T9 次之，為16.06 條；T3 和CK 最低，分別為8.03 條和8.60條。平均根長T1 最長，為6.19 cm；T4 和T6 并列，為5.63 和5.55 cm，為3.95 cm；除T1、T2、T4 和T6 大于CK 外，其余處理組平均根長均小于CK。最長根長以T6 最長，為19.90 cm；T4 次之，為15.90 cm；T7 最短，最長根長為9.70 cm；除T5、T7 和T9 小于CK，其它處理組均大于CK。最小根長以T3 最長為1.43 cm；T9 最短（0.40 cm）；其它處理組間差異性不顯著。根系效果指數(shù)以T6最高，其次為T4，CK 和T3 最低。

表3 不同處理對插穗生根的影響?Table 3 Effect of different treatments on rooting of cuttings

2.3 不同處理生根指標之間的相關(guān)分析

由表4可以看出，在不同生長調(diào)節(jié)劑對插穗各項生根指標之間，平均根數(shù)與最長根長、生根率、根系效果指數(shù)呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。平均根長與最長根長和根系效果指數(shù)呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。最長根長與生根率和根系效果指數(shù)均呈顯著性正相關(guān)（P＜0.05）。根系效果指數(shù)與生根率呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。

表4 不同處理下插穗生根指標相關(guān)性分析?Table 4 Correlation analysis of rooting indexes of cuttings under different treatments

2.4 根系生長性狀隸屬函數(shù)值及綜合評價

采用隸屬函數(shù)分析法分別對9 個處理的各項指標進行分析及綜合評價。結(jié)果如表5所示，T6 排名第1，即用200 mg/L 的IBA 處理插穗30 min，其平均隸屬函數(shù)值為0.845；T4 排名第2，僅次于T6；T9為排名第9，即用200 mg/L 的NAA 處理插穗10 min，其平均函數(shù)值為0.234。

表5 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對根系生長指標的隸屬函數(shù)值及綜合評價Table 5 Membership function values and comprehensive evaluation of root growth indexes under different plant growth regulators

2.5 生根過程中相關(guān)酶活性的動態(tài)變化

2.5.1 POD 活性的動態(tài)變化

POD 是調(diào)控植物體內(nèi)生理代謝活動的主要氧化酶，對植物生長發(fā)育起著重要的調(diào)節(jié)作用，與插穗基部根原基細胞的誘導(dǎo)及表達關(guān)系密切[24]。由圖2可知，IAA 處理組（T1、T2、T3）POD 活性呈現(xiàn)“上升—下降”的單峰趨勢，第25 天（不定根表達、形成階段）出現(xiàn)峰值，CK 的POD 活性變化趨勢同3 個IAA 處理組相同，在0～25 d總體呈現(xiàn)上升趨勢，25 d 后出現(xiàn)緩慢下降趨勢；在各時期，T3 的POD 活性均高于CK，T1 和T2均低于CK，說明T3 對插穗POD 活性的作用較T1 和T2 明顯。IBA 處理組（T4、T5、T6）的POD 活性變化總體均呈現(xiàn)“上升—下降—上升—下降”趨勢，T4 和T6 峰值分別出現(xiàn)在15 和45 d，即不定根原基誘導(dǎo)及發(fā)生皮裂和不定根快速生長、增粗階段，比IAA 處理組和NAA 處理組均提前10 d，且為雙峰趨勢；T4 和T6 的POD 活性各期間均高于CK，CK 峰值比T4 和T6 推遲10 d，且為單峰；T4 的POD 活性在15 d 峰值處小于T6，其它時間均高于T6，說明T4 對插穗內(nèi)部POD 活性效果高于T6。POD 參與生長素的代謝和細胞壁的木質(zhì)化[17]，由此表明，IBA 有利于提高插穗的POD 酶活性、加強呼吸作用以及促進細胞分裂，從而促進插條生根。T7、T8 和T9（NAA 處理組），POD 活性呈現(xiàn)“上升—下降”趨勢；在25 d（不定根表達、形成階段）POD 活性達到最大值，與IAA 處理組一致，隨后逐漸呈現(xiàn)降低趨勢；在扦插 25 d 后，3 個處理的POD 活性均高于CK，說明NAA 對于插穗的POD 酶活性有促進效果，且T7 效果顯著大于其它組。

圖2 不同處理對韃靼忍冬扦插生根過程POD 活性的影響Fig.2 Effects of different treatments on POD activity during the rooting process of Lonicera tatarica

2.5.2 PPO 活性的動態(tài)變化

PPO 能催化酚類與IAA 形成一種生根輔助因子“IAA—酚酸復(fù)合物”，在根原基誘導(dǎo)和發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[10]。由圖3可知，IAA 處理組（T1、T2、T3），PPO 活性變化總體呈現(xiàn)“上升—下降—上升—下降”的雙峰趨勢，峰值分別出現(xiàn)在25、45 d（不定根表達、形成和不定根快速生長、增粗階段），CK為單峰值，在扦插后45 d 出現(xiàn)，比其它3 組第一次峰值推遲20 d；T3在55 d 內(nèi)酶活均大于CK，其它組在25 d 前PPO活性大于CK，之后PPO 活性持續(xù)低于CK。有研究表明，當插穗內(nèi)積累高濃度的酚類物質(zhì)時，PPO活性會增高，PPO 催化的酶促反應(yīng)能夠產(chǎn)生促進插穗生根的物質(zhì)，也可能促進插穗切口細胞的愈傷分化[25]，說明T3 組中IAA 使插穗內(nèi)部 PPO 活性增高，加速插穗生根。T4、T5 和T6（IBA 處理組）PPO 活性呈現(xiàn)的趨勢基本一致，分別在15、45 d（不定根原基誘導(dǎo)及發(fā)生皮裂和不定根快速生長、增粗階段）達到峰值，且第一次峰值比IAA處理組提前10 d；在0～25 d，IBA 處理組PPO活性均高于CK 處理，在25～35 d，IBA 處理組PPO 活性均低于CK，在35 d 后，3 個處理組PPO活性又呈現(xiàn)上升趨勢。在2 次峰值內(nèi)，T4 峰值均高于T6 和T5，說明IBA 在愈傷組織形成和不定根快速生長、增粗階段對PPO 酶活性有促進效果，且T4 處理效果最明顯。T7、T8 和T9（NAA 處理組）的PPO 活性變化趨勢有差異，T7 在扦插后35 d 達到峰值，隨后保持穩(wěn)定，在55 d 又出現(xiàn)上升趨勢；T9 在15 d 和35 d 出現(xiàn)峰值后，隨后呈現(xiàn)下降趨勢，在45 d 出現(xiàn)最低值后，于55 d PPO 酶活性又呈現(xiàn)上升趨勢；T8 在15 d 出現(xiàn)峰值，隨后出現(xiàn)下降趨勢，在55 d 又呈現(xiàn)上升趨勢。在扦插25 d 后，T7 和T9 的PPO 活性均高于CK，T8 的PPO 活性在0～25 d 顯著高于T7、T9 和CK，但在25～55 d 內(nèi)，PPO 酶活性顯著低于T7 和T9，T7 在整個生根過程中，PPO 酶活性均高于T9，說明T7 對PPO 活性的作用高于T8 和T9。

圖3 不同處理對韃靼忍冬扦插生根過程PPO 活性的影響Fig.3 Effects of different treatments on PPO activity during the rooting process of Lonicera tatarica

2.5.3 SOD 活性的動態(tài)變化

SOD 作為植物體內(nèi)的第一線抗氧化系統(tǒng)，可催化清除超氧化物自由基，保護細胞免受氧化損傷[18]，因此SOD 對不定根的形成起著一定的作用。如圖4所示，IAA 處理組（T1、T2、T3），SOD活性總體變化規(guī)律大致相同，均在35 d 達到峰值（不定根伸長及發(fā)育階段）。在整個生根過程中，T1、T2、T3 三個處理的SOD 活性均大于CK，其峰值比CK 提前10d，T1 比T2 和T3 的SOD 活性高，說明IAA 對提高SOD 活性和插穗生根有一定的作用，且T1 優(yōu) 于T2 和T3。T4、T5 和T6 的SOD變化趨勢均表現(xiàn)“上升—下降”趨勢，在25 d（不定根表達、形成階段）出現(xiàn)峰值，比IAA 處理組提前10 d；T4 和T6 在45 d 出現(xiàn)最低值，其原因可能是在不定根伸長期，插穗已傷口愈合，不定根已經(jīng)產(chǎn)生，插穗在根系形成過程中產(chǎn)生的超氧自由基較少，而SOD 具有清除超氧自由基的作用，因此SOD 活性降低[26]。在插穗整個生根過程中，CK 的SOD 活性均顯著低于T4、T5 和T6；T4 的SOD 活性比T6 和T5 高，說明T4 對SOD 活性的效果較T6 和T5 明顯。T7、T8、T9（NAA 處理組）的SOD 活性為“上升—下降—上升—下降—上升”趨勢，分別在15、35 d 達到峰值，即不定根原基誘導(dǎo)及發(fā)生皮裂階段和不定根伸長及發(fā)育、大量新葉抽出階段。在扦插后35 d 內(nèi)，NAA 的3個處理組SOD 活性均大于CK，且CK 組峰值為單峰（45 d 出現(xiàn)），比其它3 個處理組推遲30 d，說明NAA 對促進SOD 活性和加速插穗的不定根的產(chǎn)生起到了一定的作用。在整個生根過程中，T8 處理SOD 活性比T7 和T9 均高。

圖4 不同處理對韃靼忍冬扦插生根過程SOD 活性的影響Fig.4 Effects of different treatments on SOD activity during the rooting process of Lonicera tatarica

3 結(jié)論與討論

3.1 討 論

3.1.1 生長調(diào)節(jié)劑對扦插生根的影響

不同生長調(diào)節(jié)劑對插穗生根作用各有不同。有研究表明，不同植物激素對刺槐嫩枝扦插生根效果不同，IBA 對不同刺槐插穗生根效果最好[27]；王瑞敏等[28]對金葉銀杏嫩枝扦插繁殖研究表明，IBA 的處理效果優(yōu)于NAA；還有學者研究顯示，IAA 對垂珠花[29]和紅砂[30]的插穗扦插生根具有促進作用。朱永超和許宏剛對藍葉忍冬進行了扦插繁殖試驗，研究表明：50 mg/L 的IBA 處理插穗60 min 可顯著增加藍葉忍冬的生根率和根數(shù)[31-32]。本試驗結(jié)果表明，韃靼忍冬插穗生根方式主要為皮部生根型以及少量的愈傷組織生根型，其原因可能是由于皮部生根與愈傷組織生根相互抑制[13]；通過對插穗的生根進程拍照觀察，不定根的形成大致分為4 個階段:不定根原基誘導(dǎo)及發(fā)生皮裂階段；不定根表達和形成階段；不定根伸長階段及發(fā)育階段；不定根快速生長和增粗階段；通過對不同處理插穗的生根指標進行比較分析得出，T4（50 mg/L IBA 處理1 h）和T6（200 mg/L IBA處理30 min）綜合生根效果較好，NAA 處理組和IAA 處理組對插穗的生根效果不明顯，這與朱永超對藍葉忍冬的研究結(jié)果相似[33]。

3.1.2 酶活性與插穗生根的關(guān)系

植物生長調(diào)節(jié)劑可顯著促進插穗內(nèi)某些酶的活性，提高淀粉和蛋白質(zhì)分解，增強細胞滲透吸水能力，加速植物組織的分化與再生[13]。在本研究中，IBA 處理組對POD 酶活性的效果顯著高于IAA 處理組和NAA 處理組，且IBA 處理組POD活性峰值均在不定根原基誘導(dǎo)及發(fā)生皮裂和不定根快速生長、增粗階段升高，這與劉潔[34]在黃心夜合的研究論點相似，認為插穗經(jīng)K-IBA 處理的POD 活性均有2 個峰值分別出現(xiàn)在不定根誘導(dǎo)階段、不定根的伸長期，說明IBA 對提高插穗的POD 酶活性具有促進作用并可加強呼吸作用以及促進細胞分裂，從而促進插條生根；而在本研究IBA 處理組（T4）對POD 活性的效果明顯。PPO活性峰值大部分出現(xiàn)在25 d（不定根表達、形成階段）和15、45 d（不定根原基誘導(dǎo)及發(fā)生皮裂和不定根快速生長、增粗階段）；PPO 是一種含銅的酶,能催化酚類物質(zhì)與IAA 縮合形成一種有利于生根的輔助因子“IAA—酚酸復(fù)合物”[29]，因此，本研究認為PPO 活性的高低與扦插生根進程有關(guān)系，即愈傷組織形成期和不定根發(fā)生時期，PPO 酶活性增高，與Bhattacharya[35]在1989年表明PPO 酶可以催化生長素代謝，促進不定根起源與發(fā)育的觀點一致，說明IAA、IBA 和NAA 對PPO 活性均有促進作用，且本試驗中，BA 促進效果更佳，T4 對PPO 活性效果最好。在不同處理中，SOD 酶活性峰值出現(xiàn)在15 d（不定根原基誘導(dǎo)及發(fā)生皮裂）、25 d（不定根表達、形成階段）、35 d（不定根伸長及發(fā)育階段），這與陳晨等對東京野茉莉插穗根系產(chǎn)生過程中SOD 活性變化趨勢一致[36]，SOD 活性峰值出現(xiàn)在不定根產(chǎn)生與伸長時期，表明不同激素處理插穗對SOD 活性有一定的作用。本研究IBA 對SOD 活性的作用高于IAA和NAA；且T4 處理效果最好。

3.2 結(jié) 論

韃靼忍冬插穗生根方式主要為皮部生根型以及少量的愈傷組織生根型。韃靼忍冬不定根的形成大致分為4 個階段：不定根原基誘導(dǎo)及發(fā)生皮裂階段；不定根表達和形成階段；不定根伸長階段及發(fā)育階段；不定根快速生長和增粗階段。IBA 處理組中，T4（50 mg/L IBA 處理1 h）和T6（200 mg/L IBA 處理30 min）綜合生根效果較好，NAA 和IAA 對插穗的生根效果不明顯。IBA 對POD、PPO、SOD 活性的作用效果較好，且IBA處理組中的T4 效果最佳，即T4（50 mg/L IBA 處理1 h）為最佳處理組。

本試驗對韃靼忍冬進行扦插繁殖技術(shù)、插穗生根過程中酶活性與插穗的關(guān)系以及生長調(diào)節(jié)劑對酶活性的影響等進行了初步研究；而植物在扦插生根過程中，插穗內(nèi)部產(chǎn)生的生理生化變化極其復(fù)雜。今后，還需深入探究韃靼忍冬扦插繁殖生根機理及生理代謝機制，完善扦插繁育體系。