楊 旭，楊志玲，王依清

（1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400；2.湖南翱康生物科技有限公司，湖南 溆浦 419300）

木姜葉柯Lithocarpus litseifolius，又名多穗柯、甜茶、胖稠，為殼斗科Fagaceae 柯屬Lithocarpus植物，廣泛分布于我國長江以南地區(qū)[1]。木姜葉柯的使用歷史可追溯到南北朝南朝劉宋景平元年?！侗静菥V目》記載，木姜葉柯“氣味甘、平，無毒，療痔，止血及血痢，止渴，活血，利小便”[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，木姜葉柯葉片中含有多種營養(yǎng)成分和藥效成分，包括多種黃酮類、三萜類、甾體及豐富的氨基酸和微量元素。其主要成分包括根皮苷、三葉苷等二氫查耳酮類化合物[3]。該類化合物的甜度為蔗糖的300 倍，熱量僅為蔗糖的三百分之一，是一類高甜、低熱、無毒性的天然甜味劑，具有甜度大、甜味清爽愉悅、后味持續(xù)時間長，在水中可溶穩(wěn)定的特點[4]。二氫查爾酮類還具有良好的藥理作用，其糖苷基在體內(nèi)發(fā)生水解，卻幾乎不參與代謝，因此對肥胖病患者和糖尿病人來說顯得尤為重要[5]。該類化合物是鈉－葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（SGLTs 和GLUTs）的競爭性抑制劑，能抑制葡萄糖在腎臟的重吸收，進而控制血糖，干預(yù)糖尿病、腎病的發(fā)生和發(fā)展，還可通過與心臟中β-腎上腺素受體結(jié)合，使心肌收縮力、心率明顯增加；還可以促進葡萄糖的分泌、降低空腹和餐后血糖水平，而不發(fā)生低血糖副作用[6-7]。

由于木姜葉柯良好的藥用價值，國內(nèi)外學(xué)者對其有效成分[3]、藥理作用[6-8]、提取工藝[9]等方面開展了細(xì)致的研究，并通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析而對其有效成分合成的關(guān)鍵基因進行了挖掘[10]。但木姜葉柯不是傳統(tǒng)意義上的藥用植物，沒有被收入《中國藥典》，作為保健品開發(fā)也是近年的事，對其質(zhì)量評價缺乏統(tǒng)一有效的指標(biāo)，對原料缺乏有效的監(jiān)管，導(dǎo)致市場上的原料來源混亂，嚴(yán)重阻礙了木姜葉柯產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展。因此，加強木姜葉柯不同種源有效成分差異的研究，確定其質(zhì)量控制的關(guān)鍵成分具有重要的意義。本研究分析了我國木姜葉柯主要產(chǎn)區(qū)不同種源木姜葉柯葉片中主要有效成分的含量差異，以期為該物種的保護、發(fā)展和可持續(xù)利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2019年4—5月選擇了9 個木姜葉柯天然種群，每個種群采集10 個健康、成熟的植株，由中國林科院亞熱帶林業(yè)研究所楊志玲研究員鑒定為殼斗科植物木姜葉柯。每個植株分東、南、西、北四個方向分別采集當(dāng)年生新稍上的幼嫩葉片和往年生枝條上的成熟葉片各10 枚。各采集地的地理氣候因子見表1。采集地的經(jīng)緯度和海拔高度用手持式GPS 記錄，采集地氣候因子來源與中國氣象科學(xué)數(shù)據(jù)共享中心平臺。

1.2 實驗方法

1.2.1 木姜葉柯根際土壤營養(yǎng)元素測定

采集木姜葉柯栽培地0～20 cm 土層的土壤，按照中華人民共和國林業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)1238—1999、1228—1999、1232—1999、1234—1999、1237—1999分別測定土壤中pH值、土壤全氮、全磷、全鉀、土壤速效氮、速效磷、速效鉀及土壤有機質(zhì)[11]含量。

1.2.2 木姜葉柯葉片有效成分含量的測定

將木姜葉柯葉片60℃烘干至恒質(zhì)量，粉碎，過40 目篩。用高效液相色譜法測定木姜葉柯葉片中根皮苷（Phlorizin）[12]、三葉苷（Trilobatin）[12]、新橙皮苷二氫查爾酮（Neosperidin dihydrochalcone）[13]、根皮素（Phloretin）[14]含量，用紫外分光光度法測定木姜葉柯葉片中總黃酮含量[15]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件對不同種源木姜葉柯葉片有效成分含量做多重比較及方差分析，并對木姜葉柯有效成分含量與環(huán)境因子作相關(guān)分析，對不同種源木姜葉柯的有效成分含量進行綜合評價。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種源木姜葉柯當(dāng)年生葉片有效成分含量差異

對不同種源當(dāng)年生葉片中有效成分含量分析可知（表3），不同種源木姜葉柯當(dāng)年生葉片中根皮苷平均含量為1.76%，其中江西安福種源含量最高，為3.53%，四川蘆山根皮苷含量最低，為0.60%；各種源當(dāng)年生葉片中三葉苷的平均含量為5.90%，其中重慶梁平種源含量最高，達(dá)19.91%，廣西巴馬種源含量最低，為1.51%；各種源當(dāng)年生葉片中新橙皮苷二氫查爾酮的平均含量為0.31%，其中重慶梁平種源含量最高，為1.25%，重慶酉陽種源含量最低，為0.02%；各種源當(dāng)年生葉片中根皮素的平均含量為0.53%，其中湖北利川種源含量最高，為4.03%，四川蘆山種源含量最低，為0.01%；各種源當(dāng)年生葉片中總黃酮含量平均為3.61%，其中重慶梁平種源含量最高，為7.41%，湖南溆浦種源含量最低，為2.27%。除根皮苷外，各種源當(dāng)年生葉片中有效成分含量差異均達(dá)到顯著水平。

木姜葉柯當(dāng)年生葉片中5 個有效成分的含量差異在9 個種源間達(dá)到了顯著或極顯著水平，而除了根皮苷含量外，其他幾種成分在各種源內(nèi)的差異并未達(dá)到顯著水平（表4）。各有效成分中，根皮苷、新橙皮苷二氫查耳酮和根皮素的變異主要來源于種源內(nèi)單株間及單株內(nèi)，種源間的方差分量從5.69～11.91%不等，而三葉苷和黃酮的主要變異來源于種源間及單株內(nèi)，種源間的方差分量分別為48.31 和33.75%（表3）。

表2 不同種源木姜葉柯土壤養(yǎng)分狀況Table 2 Soil nutrition of different L.litseifolius provenances

表3 不同種源木姜葉柯當(dāng)年生葉片有效成分含量Table 3 Content of current-year leaves of different L.litseifolius provenances

表4 不同種源木姜葉柯當(dāng)年生葉片中有效成分的方差分析Table 4 Variance analysis of the current-year leaves content of different L.litseifolius provenances

2.2 不同種源木姜葉柯往年生葉片有效成分含量差異

對不同種源往年生葉片有效成分含量差異分析可知（表5），不同種源木姜葉柯往年生葉片中根皮苷含量平均為10.99%，其中含量最高的是重慶酉陽種源，達(dá)到20.71%，含量最低的是湖北利川種源，為5.92%；不同種源往年生葉片三葉苷平均含量為0.26%，其中含量最高的是重慶梁平種源，為0.58%，含量最低的是四川蘆山種源，為0.09%；不同種源往年生葉片中新橙皮苷二氫查爾酮的平均含量為0.011%，其中含量最高的是重慶梁平種源，為0.023%，含量最低的是四川蘆山種源，為0.005%，不同種源往年生葉片中根皮素平均含量為0.016%，其中含量最高的是湖北長陽種源，為0.057%，含量最低的為湖南芷江種源，為0.007%；不同種源往年生葉片中總黃酮的平均含量為6.39%，其中含量最高的是重慶酉陽種源，為9.68%，含量最低的是四川蘆山，為3.34%。各種源不同成分的含量差異均達(dá)到極顯著水平。由表3和表5可知，往年生葉片中根皮苷和黃酮含量顯著高于當(dāng)年生葉片，但三葉苷、新橙皮苷二氫查爾酮和根皮素含量顯著低于當(dāng)年生葉片。

木姜葉柯往年生葉片中5 個有效成分中三葉苷、新橙皮苷二氫查耳酮和根皮素的含量差異在9個種源間達(dá)到了極顯著水平，而根皮苷和黃酮的含量在種源間，及5 種成分在種源內(nèi)均未達(dá)到顯著水平（表6）。各有效成分變異的主要來源于單株內(nèi)，種源間的方差分量從6.34%～13.42%不等，而種源內(nèi)單株間的方差分量從1.12%～16.12%不等（表5）。

表5 不同種源木姜葉柯往年生葉片有效成分含量差異Table 5 Content of former-year leaves of different L.litseifolius populations

表6 木姜葉柯往年生葉片有效成分的方差分析Table 6 Variance analysis of the former-year leaves content of different L.litseifolius populations

2.3 木姜葉柯葉片主要化學(xué)成分與地理氣候及土壤因子的相關(guān)分析

對不同種源木姜葉柯葉片化學(xué)成分與地理氣候及土壤因子的相關(guān)分析可知（表7～8），當(dāng)年生葉片中三葉苷、新橙皮苷二氫查爾酮及根皮素含量與緯度呈顯著負(fù)相關(guān)，三葉苷和根皮素含量與年均溫和極端最低溫度呈顯著的正相關(guān)，葉片中總黃酮含量與土壤中pH 值含量呈顯著負(fù)相關(guān)。往年生葉片中根皮素含量與維度呈顯著的負(fù)相關(guān)，與年均溫呈顯著的正相關(guān)，與極端最低溫度呈顯著的正相關(guān)，三葉苷含量與極端最高溫度呈顯著的正相關(guān)，此外，根皮苷含量與土壤中有機質(zhì)含量、土壤全氮和速效氮含量成顯著的正相關(guān)，三葉苷含量與土壤有機質(zhì)含量和土壤全磷含量呈顯著的正相關(guān)，葉片中總黃酮含量與土壤pH 值呈顯著的負(fù)相關(guān)，其余化學(xué)成分含量與各地理氣候及土壤因子不存在顯著的相關(guān)性。

表7 木姜葉柯當(dāng)年生葉片與地理氣候土壤因子的相關(guān)性分析Table 7 Ccorrelation of the current-year leaves content and geographic,meteorological and soil factors in L.litseifolius populations

3 結(jié)論與討論

3.1 討 論

1）根皮苷、根皮素、三葉苷及新橙皮苷二氫查爾酮屬于二氫查爾酮類化合物，其中根皮苷、根皮素及三葉苷最早來源于蘋果屬植物[16]，新橙皮苷二氫查爾酮最初是從天然柑橘類植物中提取的黃烷酮再合成的[4]。根皮苷、根皮素及三葉苷在蘋果屬Malus葉片中的含量分別為1.01～17.15%、0～0.09% 以及0～1.50%[16]，而以上化合物在木姜葉柯中的含量分別達(dá)到0.46～18.49%、0.01～4.03%和0.10～19.91%，除根皮苷外，其余兩種化合物的含量顯著高于蘋果屬植物。此外，柑橘類植物中僅能提取新橙皮苷和柚皮苷，再通過開環(huán)氫化合成新橙皮苷二氫查爾酮[17]。而木姜葉柯葉片中新橙皮苷二氫查爾酮不需要化學(xué)合成，可直接提取獲得，且含量可達(dá)0.01～1.25%，具有簡便、高效的特點。

表8 木姜葉柯往年生葉片與地理氣候土壤因子的相關(guān)性分析Table 8 correlation of the former-year leaves content and geographic,meteorological and soil factors in L.litseifolius populations

2）木姜葉柯葉片有效成分含量在種源間具有較大的差異，方差分析結(jié)果顯示，當(dāng)年生葉片中根皮苷、根皮素、三葉苷和新橙皮苷二氫查爾酮含量均存在著極大的變異，變異系數(shù)在93.43～325.81之間，往年生葉片中各有效成分含量的變異系數(shù)有所降低（變異系數(shù)在43.69～88.86%之間），但仍遠(yuǎn)高于杜仲Eucommia ulmoides葉片中槲皮素、異槲皮苷、多酚和總黃酮的變異系數(shù)（分別為42.42%、34.42%、23.72%和19.35%）[18]，以及黃梔子Gardenia jasminodes果實中梔子酸、綠原酸、藏紅花素和梔子苷的變異系數(shù)（分別為22.42%、20.20%、8.01、17.26%和14.79%）[19]。表明不同種源木姜葉柯存在豐富的遺傳變異，可為種源的收集、分類和良種選育提供理論依據(jù)。

3）木姜葉柯葉片中有效成分含量的含量存在著顯著的地區(qū)性差異。對木姜葉柯葉片有效成分與各種可能影響其含量的生態(tài)因子的相關(guān)分析表明，多數(shù)次生代謝產(chǎn)物的含量與緯度呈顯著的負(fù)相關(guān)，與溫度呈顯著的正相關(guān)，表明高溫有利于次生代謝產(chǎn)物的積累，這與對黃芩Scutellaria baicalensis[20]、野鴨椿屬Euscaphis[21]等植物的研究結(jié)果相似。但木姜葉柯中的主要次生代謝產(chǎn)物二氫查耳酮類化合物，其主要合成的關(guān)鍵基因包括查耳酮合成酶、查耳酮異構(gòu)酶、異黃酮合成酶[10]。研究表明，低溫能造成該類基因表達(dá)上調(diào)，從而促進這些二氫查耳酮類的合成和積累[22-23]。但我們的研究發(fā)現(xiàn)，木姜葉柯葉片有效成分含量與年均溫呈顯著正相關(guān)，這可能是由于木姜葉柯主要分布在我國的低緯度地區(qū)，不能耐受極端的低溫天氣，低溫造成查耳酮合成酶基因表達(dá)的下調(diào)，造成二氫查耳酮類化合物積累的減少[24]，從而造成其對溫暖的氣候條件的選擇性適應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)，低溫處理能使銀杏葉片中黃酮含量顯著下降[25]。土壤中的營養(yǎng)元素對當(dāng)年生葉片的影響不明顯，但對往年生葉片中的根皮苷、三葉苷等成分的影響較大。土壤中的營養(yǎng)元素會影響次生代謝產(chǎn)物的含量，這在許多植物中都得到了驗證[21,26]。植物次生代謝產(chǎn)物合成的影響因素很多，合成酶的啟動需要一定的時間，許多基因的表達(dá)是在植物生長的特定時期，如四棱豆Psophocarus tetragonolobus的繁殖器官中，成熟的種子的苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性要顯著高于幼嫩的豆莢[27]。土壤中的營養(yǎng)元素能增強許多合成酶的活性，從而促進次生代謝產(chǎn)物的合成。研究表明，對元寶楓Acer truncatum增施鉀肥能促進葉片中花色苷的含量[28]，而土壤中的腐殖質(zhì)和微量元素能促進金線蓮Anoectochilus formosanus中槲皮素、山奈酚、異鼠李素的積累[29]。木姜葉柯往年生葉片中根皮苷、三葉苷等成分與土壤有機質(zhì)及土壤含氮量顯著正相關(guān)，可能是由于它們增強了二氫查耳酮類化合物合成的關(guān)鍵酶的活性造成的。

3.2 結(jié) 論

本研究探討了不同種源木姜葉柯葉片當(dāng)年生和往年生葉片有效成分的含量差異。結(jié)果表明，木姜葉柯葉片中活性成分的含量存在著顯著的地區(qū)差異，其中江西安福、重慶梁平等種源葉片有效成分含量較高，以上結(jié)論為為木姜葉柯引種及高品質(zhì)木姜葉柯品種的選育及提供依據(jù)。同時，分析葉片有效活性成分含量與緯度、年均溫、極端最低溫度及土壤pH 值、土壤有機質(zhì)、土壤含氮量等因素密切相關(guān)。因本文所用的材料為木姜葉柯天然群體的葉片，其次生代謝產(chǎn)物的含量除了受到遺傳因素的控制外，還受到諸如群落類型、林地小氣候、地表覆蓋物等諸多因素的影響。為了精準(zhǔn)地找到木姜葉柯有效成分的綜合決定因子，進行同質(zhì)栽培試驗就顯得尤為重要。筆者希望通過木姜葉柯標(biāo)準(zhǔn)化栽培技術(shù)的研究，再結(jié)合其園藝性狀和植物成分的綜合分析，為實現(xiàn)木姜葉柯資源的培育和高效利用提供理論支持。