時(shí)寧寧 阮長(zhǎng)青 李志江 張東杰

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院1，大慶 163319)(黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，大慶 163319)(國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心3，大慶 163319)(黑龍江省雜糧加工及質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心4，大慶 163319)

植酸是由環(huán)己六醇與6個(gè)磷酸基團(tuán)結(jié)合而成，在植物中以植酸鹽形式存在，多數(shù)存在于種子中[1,2]。相關(guān)研究表明，植酸在一定程度上可以起到保護(hù)牙齒、預(yù)防腎結(jié)石以及防治糖尿病的效果，并且能夠通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤活性[3,4]，廣泛用于食品[5]、日化[6]、化工[7]等產(chǎn)業(yè)。在許多國(guó)家，谷物和豆類(lèi)是微量元素重要的食物來(lái)源，豆類(lèi)、玉米以及小麥和大米等植物籽粒大部分植酸分別存在于子葉、胚芽和糊粉層，普通的加工方式很難消除植酸帶來(lái)的影響[8-10]。此外，由于人體和單胃動(dòng)物胃腸道內(nèi)無(wú)法降解植酸，植酸進(jìn)入腸道后會(huì)與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)形成復(fù)合物，并會(huì)影響相關(guān)酶的活性，從而降低了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生物利用度[11,12]。

豆粕、麩皮、米糠等農(nóng)副產(chǎn)品等常被用于動(dòng)物飼料，相關(guān)研究也多數(shù)在于通過(guò)動(dòng)物體重、氨基酸和磷利用率等方式，來(lái)探究植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用及其降解方法[13,14]。但是關(guān)于糧食作物中植酸的提取、植酸與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)間的相互作用及其機(jī)理等相關(guān)研究相對(duì)較少。黑豆作為一種深色雜豆，具有良好的食用和藥用價(jià)值，符合當(dāng)前的消費(fèi)觀念，有關(guān)黑豆的加工產(chǎn)品如黑豆醬油、黑豆乳、黑豆納豆等[15]。植酸的熱穩(wěn)定性較好，在生產(chǎn)黑豆相關(guān)制品時(shí)如黑豆粉、炒黑豆、黑豆乳等，無(wú)法對(duì)植酸進(jìn)行有效的控制。因此，通過(guò)對(duì)黑豆中植酸的提取進(jìn)行研究，充分提取黑豆中的植酸，提升植酸質(zhì)量，是了解黑豆植酸含量、組成、相關(guān)特性以及提高黑豆?fàn)I養(yǎng)價(jià)值的基礎(chǔ)。

植酸的傳統(tǒng)提取方法耗時(shí)長(zhǎng)、提取率偏低，采用超聲波輔助手段能顯著縮短提取時(shí)間并提升植酸提取率[16]。超聲波在傳播過(guò)程中通過(guò)對(duì)溶劑的壓縮和拉伸作用會(huì)形成空化泡，當(dāng)空化泡破裂時(shí)產(chǎn)生極大的能量和負(fù)壓，從而強(qiáng)化傳質(zhì)過(guò)程。同時(shí)，空化效應(yīng)還伴隨著一系列其他效果，如局部剪切力、侵蝕、破碎以及增強(qiáng)水合作用等，這些因素導(dǎo)致了溶液中整體反應(yīng)的增強(qiáng)和固體顆粒表面積增大，使目標(biāo)物質(zhì)更易溶出[17,18]。因此，實(shí)驗(yàn)以黑豆為試材，以10%硫酸鈉-鹽酸作為浸提液，利用超聲波輔助法對(duì)黑豆中的植酸進(jìn)行提取，研究不同實(shí)驗(yàn)因素對(duì)植酸得率的影響，并通過(guò)響應(yīng)面進(jìn)行條件優(yōu)化，以期最大程度提取黑豆中的植酸，可為植酸的純化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆(龍黑1號(hào))，植酸(純度99%)，甘氨酸，濃鹽酸，三氯化鐵，磺基水楊酸，無(wú)水硫酸鈉。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-400KDE超聲波清洗器，HZQ-c氣浴恒溫振蕩器，TG16-WS高速離心機(jī)，723N可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.3 植酸的提取方法與條件優(yōu)化

1.3.1 浸提法

根據(jù)文獻(xiàn)[19,20]進(jìn)行適當(dāng)修改，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到酸浸法最佳提取工藝。稱取黑豆粉2.000 0 g于錐形瓶中，按照料液比1∶16加入pH為2的10%硫酸鈉-鹽酸溶液，于60 ℃下振蕩提取90 min，結(jié)束后于10 000 r/min離心10 min，將上清液移至50 mL容量瓶，定容備用。

1.3.2 超聲波提取及單因素實(shí)驗(yàn)

超聲波取的固定條件為：pH 2，溫度60 ℃，料液比1∶14，超聲時(shí)間20 min，超聲功率200 W。在固定其他四個(gè)條件下分別考察pH(1、2、3、4、5)，溫度(30、40、50、60、70 ℃)，料液比(1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16)，超聲時(shí)間(5、10、15、20、25 min)，超聲功率(160、200、240、280、320 W)對(duì)植酸得率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇料液比、提取pH、超聲溫度、超聲功率為實(shí)驗(yàn)因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平，以植酸得率為指標(biāo)進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平表

1.4 植酸的測(cè)定方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)文獻(xiàn)[21,22]進(jìn)行適當(dāng)修改，方法如下：分別取1 mg/mL植酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.60、0.50、0.40、0.30、0.20、0.10 mL于10 mL容量瓶中，使用甘氨酸-鹽酸緩沖溶液(pH 2.4)定容，得到濃度為0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01 mg/mL的植酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別移取5 mL于離心管中，并添加3 mL顯色劑(0.03%三氯化鐵-0.3%磺基水楊酸水溶液)，搖勻后靜置15 min，于8 000 r/min離心5 min，于498 nm處測(cè)上清液吸光度值，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 植酸含量的測(cè)定

取0.2 mL提取液于15 mL離心管中，加入4.8 mL甘氨酸-鹽酸緩沖溶液(pH 2.4)，以及3 mL顯色劑，之后步驟同1.4.1，并通過(guò)植酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出0.2 mL提取液中植酸含量。

(1)

式中：R為植酸的得率/mg/g；m為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的0.2 mL提取液中植酸的質(zhì)量/mg；M為料質(zhì)量/g。

1.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均是3次平行實(shí)驗(yàn)得到的平均值，采用OriginPro 8.5繪制單因素實(shí)驗(yàn)的直觀分析圖，使用Design-expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

植酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為y=-2.672 8x+0.782 3，其中y為測(cè)定的吸光度值，x為所測(cè)溶液中的植酸含量，方程R2=0.999 6，說(shuō)明所測(cè)溶液中植酸含量在0～0.3 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系較好。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 超聲時(shí)間對(duì)黑豆中植酸提取的影響

由圖1可知，在5～20 min范圍內(nèi)，植酸得率緩慢上升，20 min時(shí)植酸達(dá)到最大值。超聲波能夠加速溶劑滲入到原料內(nèi)部，并且會(huì)增大溶劑的流動(dòng)速度，輔以細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的濃度差，使得植酸的提取速度加快[23]。持續(xù)延長(zhǎng)超聲時(shí)間，植酸從原料溶入溶劑中，植酸含量逐漸增大，當(dāng)植酸的溶出達(dá)到平衡后，此時(shí)如果繼續(xù)延長(zhǎng)浸提時(shí)間，細(xì)胞破碎程度增大，游離出的部分植酸會(huì)與環(huán)境中的其他物質(zhì)形成復(fù)合物從而使植酸含量呈現(xiàn)出小幅度的下降趨勢(shì)[24,25]。因此選擇超聲20 min做為最佳提取時(shí)間。

2.2.2 溶液酸度對(duì)黑豆中植酸提取的影響

由圖1可知，在超聲波條件下浸提液的pH值對(duì)植酸得率的影響相對(duì)較大，隨著pH的升高，植酸得率先上升后下降，在pH 2時(shí)達(dá)到最大。在低pH值的環(huán)境下植酸與陽(yáng)離子之間的結(jié)合力減弱，植酸變成游離狀態(tài)，但是如果pH過(guò)低，由于一些酸性多糖和蛋白的溶出量會(huì)增大，又會(huì)使游離植酸含量降低[26]。因此選擇pH 2為最佳提取酸度。

2.2.3 超聲溫度對(duì)黑豆中植酸提取的影響

由圖1可知，在30～60 ℃范圍內(nèi)，隨著浸提溫度的升高，植酸含量也在不斷增大，在60 ℃時(shí)達(dá)到最大值，若繼續(xù)增加溫度，植酸得率開(kāi)始下降。適當(dāng)?shù)纳郎赜兄诩涌靷髻|(zhì)過(guò)程，使植酸更易溶出，但是溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致蒸汽壓增大，更多的溶劑蒸汽進(jìn)入氣泡腔內(nèi)，使空化泡的破裂強(qiáng)度較小，從而減弱超聲效果[27]。另外，黑豆蛋白含量較高，而蛋白質(zhì)在較高溫度下會(huì)發(fā)生變性，從而聚集沉淀，包裹部分植酸存在于殘?jiān)?，從而使提取液中植酸的含量減少[28,29]。因此選擇60 ℃最為最佳提取溫度。

2.2.4 料液比對(duì)黑豆中植酸提取的影響

由圖1可知，在料液比1∶8～1∶16的范圍內(nèi)，植酸得率隨著料液比的增大先迅速增加，之后在1∶14時(shí)達(dá)到最大。隨著料液比的增大，黑豆粉在溶劑中可以處于一種分散狀態(tài)，更多的溶劑更有利于植酸的溶出，并且植酸的擴(kuò)散速率也會(huì)隨之增大，使植酸能夠充分進(jìn)入到溶劑中。而超聲波所產(chǎn)生的各種效應(yīng)可以使溶劑能更好地滲透到植物體內(nèi)，從而提高溶劑滲透性，減少對(duì)所用溶劑的依賴。但是料液比過(guò)大，再加上超聲波的作用，原料中的其他物質(zhì)也會(huì)溶出，從而在一定程度上降低溶劑中的植酸含量[30]。因此選擇1∶14作為提取的最佳料液比。

2.2.5 超聲功率對(duì)黑豆植酸提取的影響

由圖1可知，在超聲功率160～240 W的范圍內(nèi)，植酸含量逐漸增大，在240 W時(shí)植酸得率達(dá)到最大值，此時(shí)繼續(xù)增大超聲功率，植酸得率則出現(xiàn)下降趨勢(shì)。超聲波的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、穿孔效應(yīng)等共同作用使原料分子發(fā)生劇烈碰撞，細(xì)胞破裂，隨著功率的增大，該作用不斷增強(qiáng)，使得植酸得率隨著功率的增加而增大，但是功率過(guò)大也會(huì)導(dǎo)致部分植酸降解為低級(jí)磷酸肌醇，以及增加雜質(zhì)的含量，使植酸得率下降[31,32]。因此選擇240 W為最佳超聲提取功率。

圖1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面結(jié)果與方差分析

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)得到的方案與實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，使用Design-expert8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合與顯著性檢驗(yàn)，得到方差分析表(表3)。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

通過(guò)二次線性回歸擬合，得到的關(guān)于植酸得率的回歸方程為：Y=12.43-0.17A+0.052B+0.21C+0.005D+0.17AB-0.023AC+0.21AD-0.17BC-0.29BD-0.24CD-1.55A2-0.52B2-0.68C2-0.29D2

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方差分析

2.3.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖的響應(yīng)曲面表現(xiàn)了各因素對(duì)植酸得率的影響，曲面弧度越大表明此因素對(duì)植酸得率的影響越大，反之影響越小。等高線反映的是兩兩因素間交互作用的大小，等高線由圓形至橢圓形代表兩因素間的交互作用由小至大。通過(guò)分析交互作用顯著的響應(yīng)面與等高線圖，可知對(duì)植酸得率影響最大的是pH值，其次是料液比和溫度，而超聲功率的影響最小，響應(yīng)曲面相對(duì)平緩。兩兩因素間的交互作用強(qiáng)弱順序?yàn)椋築D>CD>AD。

2.3.3 最佳工藝條件的確定

經(jīng)響應(yīng)面分析并結(jié)合回歸方程得出黑豆中植酸的最佳提取工藝為：pH 2、溫度60 ℃、料液比1∶14、超聲功率236 W、時(shí)間20 min，植酸得率預(yù)測(cè)值為12.35 mg/g。根據(jù)實(shí)際情況，將提取工藝調(diào)整為：pH 2、溫度60 ℃、料液比1∶14、超聲功率240 W、時(shí)間20 min，在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，植酸得率平均值為12.39 mg/g，與預(yù)測(cè)值誤差較小。因此，該模型可用于黑豆植酸的提取工藝，具有實(shí)際意義。

2.4 超聲波輔助提取與浸提法實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

由表4可知，超聲波輔助法與浸提法相比，植酸得率提升了13.56%，并且減少了溶劑的使用，縮短了提取時(shí)間。

表4 超聲輔助法與浸提法結(jié)果對(duì)比

3 討論

超聲波輔助提取在我國(guó)最早應(yīng)用于中草藥有效成分的提取，其主要特點(diǎn)是縮短提取時(shí)間、提高得率并且不破壞有效成分，目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工等行業(yè)。超聲波所產(chǎn)生的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、毛細(xì)管效應(yīng)等各種效應(yīng)在整個(gè)提取過(guò)程中協(xié)同、反復(fù)作用使得整個(gè)提取過(guò)程速度加快，細(xì)胞破碎程度增大，因此具有縮短時(shí)間、減少溶劑用量、提高得率的特點(diǎn)[33-35]。有研究發(fā)現(xiàn)，植酸除了與金屬陽(yáng)離子結(jié)合形成植酸鹽外，還會(huì)與蛋白質(zhì)結(jié)合，儲(chǔ)存在蛋白質(zhì)儲(chǔ)存液泡的膜結(jié)合腔室，其中含有植酸晶體和以溶解液泡為特征的蛋白質(zhì)，而超聲波可能會(huì)破壞腔室釋放植酸，從而提升植酸得率[36]。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，pH值和料液比對(duì)黑豆中植酸提取的影響較大，主要是因?yàn)橹菜岬尿夏芰^強(qiáng)，較低pH下會(huì)與蛋白質(zhì)形成二元復(fù)合物，而較高pH下會(huì)與金屬和蛋白質(zhì)形成三元復(fù)合物，因此在提取時(shí)應(yīng)對(duì)溶液pH和料液比進(jìn)行嚴(yán)格控制。通過(guò)與傳統(tǒng)浸提法相比，超聲波輔助提取用時(shí)少、溶劑用量少并且植酸得率升高，主要原因是超聲波的空化效應(yīng)及其產(chǎn)生的其他效應(yīng)增大了傳質(zhì)速度，并在短時(shí)間內(nèi)破壞原料結(jié)構(gòu)，使溶劑更快的深入到細(xì)胞內(nèi)，加快了植酸的溶出。

使用水浴形式進(jìn)行超聲波輔助提取時(shí)應(yīng)注意的是，超聲波的強(qiáng)度會(huì)因水浴、容器的形狀和厚度等因素受到一定的影響，因此應(yīng)選擇平底、厚度較薄的容器，以減少超聲波的衰減[34]。由于超聲波在提取過(guò)程出會(huì)釋放熱量，功率越大對(duì)溫度的影響越大，使得實(shí)際溫度會(huì)超過(guò)設(shè)定溫度。另外，超聲波的頻率越低其空化效應(yīng)越強(qiáng)，理論上提取效果也越好，因此應(yīng)該對(duì)較低或較高超聲波功率以及超聲頻率對(duì)植酸提取的影響進(jìn)行研究[18]。

4 結(jié)論

本研究建立了超聲波輔助法提取黑豆中植酸的工藝條件，相對(duì)于傳統(tǒng)提取方式減少了溶劑的使用量，并且很大程度上縮短了提取時(shí)間。實(shí)驗(yàn)以黑豆為原料，選擇10%硫酸鈉-鹽酸作為浸提液，考察了pH、溫度、料液比、時(shí)間、超聲功率對(duì)黑豆中植酸提取的影響，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，獲得最佳提取工藝為：pH 2、溫度60 ℃、料液比1∶14、超聲功率240 W、時(shí)間20 min, 在此條件下植酸得率為12.39 mg/g，相對(duì)于浸提法，超聲波輔助法提取植酸得率提升了13.56%。