宮穎新，王萍，白玉坤，張桂枝，焦晗亮，劉偉棟，李楊，祁艷衛(wèi)

（河北省兒童醫(yī)院普外二科，河北石家莊050031）

膽道閉鎖是新生兒、嬰幼兒出現(xiàn)阻塞性黃疸的最主要病因之一，具體病理表現(xiàn)為肝內(nèi)外膽管進(jìn)行性炎癥及纖維性梗阻，隨病情持續(xù)進(jìn)展后續(xù)可出現(xiàn)肝纖維化、肝硬化，嚴(yán)重可導(dǎo)致小兒死亡[1-3]。膽道閉鎖患兒行手術(shù)治療的預(yù)后差異較大，故對(duì)其發(fā)病機(jī)制、防治手段等探索具有重要的臨床意義。microRNA 是一類高度保守的小分子，參與細(xì)胞增殖、分化、胚胎發(fā)育、信號(hào)傳導(dǎo)等多個(gè)生命過程，且在腫瘤發(fā)生過程中也扮演重要角色。有研究[4]指出microRNA 在膽道閉鎖的發(fā)生中扮演重要角色。且AFONSO[5]等研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-21（miR-21）消融術(shù)可預(yù)防膽汁淤積癥患者的肝損傷和壞死。膽道閉鎖患兒膽汁淤積嚴(yán)重，但國(guó)內(nèi)關(guān)于miR-21 在膽道閉鎖病程中扮演角色的研究極少。本文探討膽道閉鎖患兒血清中miR-21 的表達(dá)水平，并分析其具體表達(dá)量與肝纖維化的內(nèi)在聯(lián)系，旨在明確miR-21 對(duì)膽道閉鎖病情進(jìn)展的影響，并為后續(xù)疾病治療干預(yù)等提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年7月—2019年7月河北省兒童醫(yī)院收治的先天性膽道閉鎖患兒76 例作為膽道閉鎖組。其中，男性36 例，女性40 例；年齡1～6 個(gè)月，平均年齡（3.17±0.49）個(gè)月。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)葛西探查、膽道造影及病理確診為膽道閉鎖；②符合手術(shù)指征，既往無相關(guān)治療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并先天性心臟病等其他嚴(yán)重先天性疾病；②合并基礎(chǔ)性肝臟病變。選取同期在本院進(jìn)行體檢的健康嬰幼兒50 例作為正常對(duì)照組，各項(xiàng)檢查結(jié)果均在正常范圍內(nèi)、未合并明顯先天性疾病，其監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。其中，男性23 例、女性27 例，年齡1～5 個(gè)月，平均年齡（3.21±0.68）個(gè)月。兩組小兒的基礎(chǔ)資料分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)miR-21 mRNA相對(duì)表達(dá)量

膽道閉鎖組患兒在術(shù)前1 周內(nèi)收集外周靜脈血標(biāo)本；正常對(duì)照組小兒在體檢時(shí)留取外周靜脈血標(biāo)本。標(biāo)本收集后2 h內(nèi)以3 000 r/min離心10 min，分離上層血清并置于-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。采用qRT-PCR 法檢測(cè)血清中miR-21 mRNA 相對(duì)表達(dá)量。其引物序列為正向：5'-AGCTTGACCGTAGCGGATG-3'；反向：3'-TCGAAGCTGAAAGCTGAGT-5'。具體步驟：提取總RNA、測(cè)定RNA 濃度及純度、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、qRT-PCR 反應(yīng)。總RNA 提取試劑盒購(gòu)自加拿大Norgen 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司，PCR 試劑盒購(gòu)自北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司。以U6為內(nèi)參，2-△△Ct法計(jì)算各組受試小兒miR-21 mRNA 相對(duì)表達(dá)量。膽道閉鎖組患兒根據(jù)miR-21 mRNA 相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)進(jìn)一步分為高miR-21 組和低miR-21 組，每組38 例。

1.3 血清總膽紅素檢測(cè)

取1.2 血液標(biāo)本，使用德國(guó)利霸XL300 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)其血清總膽紅素水平。

1.4 肝組織纖維化評(píng)分及天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶與血小板比值（APRI）計(jì)算

調(diào)取病理科膽道閉鎖患兒術(shù)中肝組織切片，采用改良HAI 的Ishak 系統(tǒng)進(jìn)行肝纖維化評(píng)分[6]。采用0～6 分評(píng)分值，隨分值增加，肝纖維化程度加重。其中，0 分為無纖維化，1～3 分為低纖維化，4～6 分為高纖維化。同時(shí)采用APRI 肝纖維化無創(chuàng)診斷模型對(duì)患者肝纖維化程度進(jìn)行評(píng)估[7]，計(jì)算APRI，計(jì)算公式為APRI=（血清AST/60）×（100/血小板計(jì)數(shù)）。

1.5 血清肝纖維化指標(biāo)檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清標(biāo)本中肝纖維化指標(biāo)的水平，包括層粘連蛋白（LN）、透明質(zhì)酸酶（HA）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原（Ⅳ-Col）。酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司。

1.6 上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)分子相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)

取膽道閉鎖組患兒的術(shù)中病變肝臟組織標(biāo)本，采用qRT-PCR 法檢測(cè)EMT 相關(guān)分子的表達(dá)水平，其引物序列分別為E-cadherin正向：5'-AGCTGGTT GACTAGCGTAGT-3'，反向：3'-CTAAGCTGATGGC GTAGTA-5'；ZEB1正向：5'-TAGCTGAGCGGCTGA GAT-3'，反向：3'-ATCGGATGCGGGAACTTAGC-5'。以β-catenin為內(nèi)參，正向：5’-GCTGGCCCCAGCC GCTGGAG-3’，反向：5’-GAGTGCAGGGTCAGC ACTAC-3’。具體檢測(cè)步驟同1.2。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)分析用Pearson 法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-21 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

膽道閉鎖組患兒的miR-21 mRNA相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)為9.33，高miR-21 組、低miR-21 組、正常對(duì)照組血清miR-21 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=398.075，P=0.000），高miR-21 組高于低miR-21 組（t=5.818，P=0.000），低miR-21 組高于正常對(duì)照組（t=25.095，P=0.000）。見表1。

表1 各組小兒血清miR-21 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

表1 各組小兒血清miR-21 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

注：①與正常對(duì)照組比較，P<0.05；②與低miR-21組比較，P<0.05。

microRNA-21 mRNA組別n 11.46±2.13①②8.18±1.14①3.04±0.78高miR-21組低miR-21組正常對(duì)照組38 38 50

2.2 血清總膽紅素水平的比較

高miR-21 組、低miR-21 組、正常對(duì)照組血清總膽紅素水平比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=516.478，P=0.000），高miR-21 組高于低miR-21 組（t=7.754，P=0.000），低miR-21 組高于正常對(duì)照組（t=28.913，P=0.000）。見表2。

表2 各組小兒血清總膽紅素水平的比較 （mg/dl，±s）

表2 各組小兒血清總膽紅素水平的比較 （mg/dl，±s）

注：①與正常對(duì)照組比較，P<0.05；②與低miR-21組比較，P<0.05。

血清總膽紅素組別n 21.31±3.76①②15.48±2.71①4.10±0.57高miR-21組低miR-21組正常對(duì)照組38 38 50

2.3 肝組織纖維化評(píng)分及APRI值的比較

高miR-21 組與低miR-21 組肝組織纖維化評(píng)分、APRI 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），高miR-21 組的肝組織纖維化評(píng)分、APRI 高于低miR-21 組（P<0.05）。兩組纖維化程度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

表3 不同miR-21表達(dá)水平的膽道閉鎖患兒肝組織纖維化評(píng)分及APRI比較

2.4 血清肝纖維化指標(biāo)的比較

膽道閉鎖患兒中，兩組血清LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-Col 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），高miR-21 組高于低microRNA-21 組。見表4。

表4 不同microRNA-21表達(dá)水平的膽道閉鎖患兒血清肝纖維化指標(biāo)水平比較 （n=38，±s）

表4 不同microRNA-21表達(dá)水平的膽道閉鎖患兒血清肝纖維化指標(biāo)水平比較 （n=38，±s）

組別LN/（μg/ml）HA/（mg/L）PCⅢ/（μg/L）Ⅳ-Col/（μg/L）高miR-21組低miR-21組t 值P 值218.39±30.77 142.53±19.86 12.769 0.000 194.37±25.22 128.04±15.19 13.888 0.000 187.51±22.69 141.12±18.63 9.741 0.000 161.07±22.85 99.63±11.74 14.743 0.000

2.5 EMT相關(guān)分子相對(duì)表達(dá)量的比較

膽道閉鎖患兒中，兩組肝臟組織E-cadherin mRNA 的表達(dá)量和ZEB1 mRNA 的表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），高miR-21 組Ecadherin mRNA 的表達(dá)量低于低miR-21 組，ZEB1 mRNA 的表達(dá)量高于低miR-21 組。見表5。

表5 不同miR-21表達(dá)水平的膽道閉鎖患兒肝臟組織EMT相關(guān)分子mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 （n=38）

2.6 相關(guān)性分析

膽道閉鎖患兒血清miR-21 水平與血清總膽紅素水平、肝組織纖維化評(píng)分、APRI 值呈正相關(guān)（r=0.546、0.669 和0.578，P=0.023、0.014 和0.019）；與肝纖維化指標(biāo)LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-Col 的水平呈正相關(guān)（r=0.781、0.663、0.628 和0.503，P=0.000、0.014、0.018 和0.037）；與E-cadherin mRNA 相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.614，P=0.018）；與ZEB1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)（r=0.607，P=0.019）。

3 討論

miR-21 是重要的microRNA 之一，除了參與增殖、凋亡、生殖等多個(gè)生命過程，越來越多研究發(fā)現(xiàn)其在各種病理狀態(tài)下也發(fā)揮重要作用，如CHEN 等[8]研究指出miR-21 參與缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的小鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡；SOEDA 等[9]認(rèn)為miR-21在預(yù)測(cè)胃癌患者腹膜復(fù)發(fā)方面意義重大。膽道閉鎖約占新生兒長(zhǎng)期阻塞性黃疸的50%左右，可導(dǎo)致淤膽性肝硬化，最終發(fā)生肝衰竭，是小兒肝移植最常見的適應(yīng)證。手術(shù)是膽道閉鎖最有效的治療方法，但鑒于目前肝源有限的現(xiàn)狀，積極延緩膽道閉鎖患兒的肝纖維化進(jìn)程，增加患兒可等待手術(shù)的時(shí)間對(duì)患兒最終治療結(jié)局的改善有重要意義，故需積極明確對(duì)膽道閉鎖患兒肝纖維化產(chǎn)生重要影響的分子靶點(diǎn)。目前國(guó)外研究[10]指出miR-21 可能是膽汁淤積性兒科肝病的重要病因?qū)W標(biāo)志物。膽道閉鎖是最嚴(yán)重的膽汁淤積性兒科疾病之一，目前國(guó)內(nèi)關(guān)于miR-21 與該病病情的內(nèi)在聯(lián)系研究不多。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膽道閉鎖患兒血清中miR-21 mRNA 相對(duì)表達(dá)量與健康小兒比較有了大幅升高，推測(cè)異常高表達(dá)的miR-21 可能參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。血清總膽紅素水平是反映膽道閉鎖患兒病情嚴(yán)重程度的最常用指標(biāo)，文中膽道閉鎖組患兒血清總膽紅素水平較正常小兒大幅上升，且其中高miR-21 組上升更為顯著，相關(guān)性分析進(jìn)一步證實(shí)膽道閉鎖患兒血清miR-21 表達(dá)量與血清總膽紅素水平呈正相關(guān)關(guān)系，初步說明高miR-21 表達(dá)對(duì)膽道閉鎖病情嚴(yán)重程度有指向性。關(guān)于miR-21 在膽道閉鎖患兒中表達(dá)上調(diào)并預(yù)示病情較重的具體原因，目前尚未有結(jié)論、有待后續(xù)基礎(chǔ)研究深入明確。

肝纖維化是膽道閉鎖患兒膽汁淤積持續(xù)加重后對(duì)肝臟組織產(chǎn)生損害的最終結(jié)果，也是導(dǎo)致患兒治療預(yù)后不佳及死亡的直接原因之一。有研究指出miR-21 可調(diào)節(jié)肺纖維化[11]、心肌纖維化[12]進(jìn)程，其是否也通過調(diào)節(jié)膽道閉鎖患兒的肝纖維化進(jìn)程從而左右整體病情及治療結(jié)局目前尚無結(jié)論。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高miR-21 組患兒的肝組織纖維化評(píng)分、APRI 均較高，初步說明miR-21 高表達(dá)對(duì)膽道閉鎖患兒肝纖維化的促進(jìn)作用。檢測(cè)血清肝纖維化指標(biāo)水平是佐證纖維化病情嚴(yán)重程度的常用手段，主要包括LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-Col，既往多用于衡量慢性肝病的炎癥活動(dòng)度及纖維化程度[13-14]。本文中高miR-21 組患兒上述纖維化指標(biāo)的水平較高，進(jìn)一步佐證miR-21 在促進(jìn)膽道閉鎖患兒肝纖維化進(jìn)程方面的作用。

目前大量研究[15-16]提示EMT 可促進(jìn)產(chǎn)生過多的肌成纖維細(xì)胞并使細(xì)胞外基質(zhì)大量堆積，最終導(dǎo)致器官出現(xiàn)纖維化。在膽道閉鎖進(jìn)程中，隨膽汁淤積加重肝細(xì)胞EMT 進(jìn)程加速，共同誘導(dǎo)纖維化促進(jìn)因子TGF-β1的過表達(dá)并導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生發(fā)展[17-18]。E-cadherin 是EMT 進(jìn)程的重要分子，ZEB1可通過抑制E-cadherin 表達(dá)而促進(jìn)EMT 發(fā)生發(fā)展[19-21]。本研究高miR-21 組患兒肝臟病灶組織ZEB1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量較高，而E-cadherin mRNA相對(duì)表達(dá)量較低，說明miR-21 高表達(dá)預(yù)示著旺盛的EMT 過程，推測(cè)miR-21 可能通過促進(jìn)肝細(xì)胞EMT 而加速其纖維化過程，從而促進(jìn)膽道閉鎖患兒發(fā)生肝纖維化。關(guān)于miR-21 對(duì)EMT 產(chǎn)生影響的直接機(jī)制研究目前涉及極少，有待后續(xù)基礎(chǔ)研究進(jìn)一步深入明確。

綜上所述，膽道閉鎖患兒血清中miR-21 mRNA 相對(duì)表達(dá)量水平異常升高，且與患兒肝纖維化程度一致，可能通過調(diào)節(jié)EMT 過程而實(shí)現(xiàn)上述作用，但具體機(jī)制有待后續(xù)細(xì)胞研究進(jìn)一步開展明確。