邱顯榮，申 瑤，林 萃

1.廣東省珠海市婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣東珠海 519001；2.廣東省中醫(yī)院珠海醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東珠海 519015

非平衡嵌合體是導(dǎo)致胎兒先天性缺陷的原因之一，傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)檢查可能會(huì)漏檢低水平的嵌合體，除非加大核型的分析數(shù)量。染色體微陣列分析(CMA)技術(shù)的應(yīng)用能提高染色體異常嵌合的檢出率，能檢出嵌合比例為10%～20%的低水平嵌合[1-2]。衍生染色體，即由2條或以上染色體結(jié)構(gòu)重排，或是由于單條染色體內(nèi)發(fā)生多種畸變而產(chǎn)生，具有完整的著絲粒。但傳統(tǒng)的G顯帶核型分析由于分辨率不高，很難確定衍生染色體片段的來源、大小和斷裂點(diǎn)，更無法檢測(cè)出染色體亞顯微結(jié)構(gòu)異常。本研究中，筆者聯(lián)合應(yīng)用核型分析與CMA技術(shù)，最終確定胎兒的嵌合比例與衍生染色體的來源，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 孕婦，32歲，配偶為非近親。既往體健，否認(rèn)家族遺傳病史，孕5次，流產(chǎn)3次。曾足月順產(chǎn)一男嬰，健康。孕13周時(shí)無創(chuàng)產(chǎn)前DNA檢測(cè)(NIPT)報(bào)告21、18、13-三體綜合征低風(fēng)險(xiǎn)，但提示9號(hào)染色體部分重復(fù)，孕22+1周B超提示胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩，室間隔缺損、單臍動(dòng)脈、不排除多囊腎、羊水少。孕婦在知情同意下行羊水穿刺術(shù)，抽取羊水同時(shí)做G顯帶核型分析和基因芯片檢查。

1.2方法

1.2.1NIPT評(píng)估胎兒常見染色體非整倍體患病風(fēng)險(xiǎn) 用乙二胺四乙酸抗凝的離心管抽取孕婦外周血5 mL，2～8 ℃低溫條件下離心分離血漿，-70 ℃以下超低溫保存。采用磁珠法DNA提取試劑盒(深圳華大基因)抽提含有胎兒游離DNA的孕婦血漿DNA，使用胎兒染色體非整倍體(T21、T18、T13)檢測(cè)試劑盒(深圳華大基因)對(duì)母血游離DNA進(jìn)行特定序列接頭連接、擴(kuò)增及上機(jī)測(cè)序，然后通過與陽性判斷值比較進(jìn)行胎兒21、18、13號(hào)染色體非整倍體情況的判斷。應(yīng)用BGISEQ-500基因測(cè)序儀(深圳華大基因)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序方法為聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序法，測(cè)序深度為×0.1。

1.2.2G顯帶核型分析 對(duì)胎兒取20 mL羊水做常規(guī)G顯帶核型分析。用改良原位法培養(yǎng)制備染色體，G顯帶處理。非嵌合體計(jì)數(shù)20個(gè)核型，嵌合體計(jì)數(shù)100個(gè)核型。染色體核型按《2016人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制(ISCN)》描述。

1.2.3CMA 抽取羊水10 mL，采用QIAamp DNA Mini試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)提取和純化全基因組DNA，應(yīng)用Affymetrix 750K試劑盒(美國(guó)ThermoFisher公司)對(duì)DNA進(jìn)行酶切、連接、PCR擴(kuò)增、純化、片段化、標(biāo)記、雜交等處理，最后應(yīng)用配套的ChAS軟件分析染色體的拷貝數(shù)變異(CNV)。CNV的分析標(biāo)準(zhǔn)是以50個(gè)標(biāo)記、100 kb為最佳臨界值進(jìn)行分析；雜合性缺失或純合狀態(tài)以5 Mb的分辨率進(jìn)行分析，包含明確印記致病基因的純合狀態(tài)區(qū)域報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)染色體片段≥5 Mb，不包含明確印記致病基因的純合狀態(tài)區(qū)域報(bào)告片段為染色體片段≥10 Mb。

1.2.4熒光原位雜交技術(shù)(FISH)分析 采用廣州和能生物科技有限公司生產(chǎn)的GSP PD-L1(Red)和CSP9(Green)探針進(jìn)行原位雜交，經(jīng)Zeise熒光顯微鏡觀察，F(xiàn)ISH軟件照相分析熒光信號(hào)。

2 結(jié) 果

2.1NIPT檢測(cè)結(jié)果 21、18、13-三體綜合征篩查低風(fēng)險(xiǎn)，但9號(hào)染色體異常。

2.2核型分析結(jié)果 胎兒核型為47,Xn,+der(9)del(9)(q21q34)dup(9)(p12p24)[10]/46,Xn[90]。

2.3CMA檢測(cè)結(jié)果 對(duì)羊水行CMA，胎兒在chr9p24.3p13.2位置檢出一段約64.9 Mb的2.43拷貝重復(fù)，檢測(cè)結(jié)果為arr[GRCH37]9P24.3P13.2(208454-68216577)x2-3，涉及DOCK8、KANAK1、DMRT1等164個(gè)OMIM基因。

2.4FISH驗(yàn)證結(jié)果 為9號(hào)染色體短臂定制探針，對(duì)CMA測(cè)序結(jié)果提示的chr9p24.3p13.2重復(fù)片段進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)二者結(jié)論一致，見圖1。

注：箭頭所示為chr9p24.3p13.2重復(fù)。

3 討 論

9p-三體綜合征由RETHOR等[3]應(yīng)用顯帶技術(shù)識(shí)別證實(shí)并于1970年首次報(bào)道。1975年CENTERWALL等[4]確定了9p-三體綜合征的畸變類型，其畸變大多數(shù)源自親代的染色體平衡易位，少部分為新發(fā)突變。9p-四體綜合征較罕見，在產(chǎn)前診斷羊水穿刺中9p-四體綜合征的檢出率約為0.002%[5]，9p-四體綜合征中約30%為嵌合體[6]。其組成類型主要有：9號(hào)染色體整個(gè)短臂的等臂、整個(gè)短臂和長(zhǎng)臂的部分異染色質(zhì)區(qū)的等臂、整個(gè)短臂和長(zhǎng)臂延伸到部分常染色質(zhì)區(qū)的等臂。迄今為止，已經(jīng)報(bào)道的9p-四體綜合征僅60余例，其中產(chǎn)前診斷病例僅20例[7]。本研究中病例為9號(hào)染色體整個(gè)短臂的等臂i9(p)。產(chǎn)生機(jī)制多為減數(shù)分裂Ⅱ期不分離和重排，導(dǎo)致9p的重復(fù)和長(zhǎng)臂的缺失，從而形成9p等臂，通常為母源性[8]。

9p-四體綜合征的臨床癥狀與9p-三體綜合征相似，如生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、智力嚴(yán)重缺陷，具有眼間距寬、眼裂和嘴角下斜、環(huán)狀耳等頭面部異常[3]，先天性心臟病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常、腎臟異常、骨骼畸形、泌尿生殖器異常等[9-10]。但9p-四體綜合征的存活率更低，表型更嚴(yán)重。許多9p-四體綜合征的異常發(fā)現(xiàn)源于胎兒出現(xiàn)多種先天性異常而進(jìn)行染色體核型分析。其中最常見的是巨腦室及Dandy-Walker畸形(60%)，其次依次為唇腭裂(55%)、宮內(nèi)發(fā)育遲緩(45%)[11]。DHANDHA等[12]和NAKAMURA等[13]報(bào)道了被診斷為9p-四體綜合征的產(chǎn)前超聲異常還包括腦室增大、胼胝體發(fā)育不全、蚓部發(fā)育不全、椎體異常、心臟異常、泌尿生殖系統(tǒng)異常、肢體畸形、鼻骨缺失、先天性膈疝等。

9號(hào)染色體p22p24區(qū)是9p-四體綜合征的關(guān)鍵區(qū)域。9p22.1p22.3區(qū)段重復(fù)具有典型顱面部異常，9p21.2p21.3區(qū)段重復(fù)與語言發(fā)育遲滯有關(guān)[14]。而9p22p24區(qū)段的DOCK8、KANK1、DMRT1、VLOLR基因明確與多種疾病及智力低下有關(guān)，KANK1的拷貝數(shù)變異與中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺陷有關(guān)。BOXILL等[15]認(rèn)為9p區(qū)域包含一個(gè)或多個(gè)涉及脈絡(luò)叢生長(zhǎng)調(diào)控的基因，與9p-三體綜合征相比，9p-四體綜合征患者似乎更容易發(fā)生脈絡(luò)叢增生。二者最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常是胼胝體異常和腦積水。DMRT1基因?qū)儆谝粋€(gè)鋅脂樣的DNA結(jié)合序列(DM域)，DM域是脊椎動(dòng)物性別決定途徑中一個(gè)古老而保守的組成部分。當(dāng)該基因出現(xiàn)CNV時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)睪丸發(fā)育缺陷和XY女性化。VERHEIJ等[16]認(rèn)為9號(hào)染色體上某些基因的超表達(dá)可能導(dǎo)致睪丸功能低下和泌尿生殖系統(tǒng)異常。VLDLR基因可以轉(zhuǎn)導(dǎo)多種細(xì)胞外信號(hào)穿過神經(jīng)細(xì)胞膜進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)突觸的可塑性并對(duì)海馬的特殊學(xué)習(xí)和記憶功能具有重要作用。這些基因拷貝數(shù)的改變可能對(duì)智力和骨骼的發(fā)育產(chǎn)生影響[14]。本研究中胎兒核型的衍生染色體經(jīng)過CMA確認(rèn)為9p的重復(fù)。因其片段覆蓋了9p-四體綜合征的關(guān)鍵區(qū)域，故會(huì)呈現(xiàn)出與之相關(guān)的典型癥狀，是其發(fā)病的真正原因。

綜上所述，對(duì)正在進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷和基因檢測(cè)的父母進(jìn)行遺傳咨詢時(shí)，除了常見的染色體畸變外，還應(yīng)包括罕見的，但在臨床上同樣重要的相關(guān)基因組。高分辨率全基因組掃描技術(shù)在臨床中的應(yīng)用將會(huì)明顯提高不明來源復(fù)雜染色體畸變的診斷效率，能夠?yàn)椴∫虻慕忉?、個(gè)體化的診療和遺傳咨詢提供科學(xué)合理的遺傳學(xué)依據(jù)。