汪新芳 馬 滕

山東省棗莊市中醫(yī)醫(yī)院 北京中醫(yī)藥大學(xué)棗莊醫(yī)院眼科，山東棗莊 277000

青光眼是一種因視神經(jīng)退行性病變所致視功能 損害的疾病，其發(fā)病機(jī)制至今不明，其主要特征為急性高眼壓[1-3]。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cells，RGCs）凋亡與壞死是導(dǎo)致青光眼視神經(jīng)損害的主要原因，保護(hù)青光眼視神經(jīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是保護(hù)RGCs[4-5]。雷公藤甲素是從我國傳統(tǒng)中藥雷公藤中提取的主要有效成分之一，其主要藥理活性為抗炎和免疫抑制[6-7]。文獻(xiàn)報(bào)道[8]，雷公藤甲素能夠抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，但其用于急性青光眼的有關(guān)報(bào)道目前較為少見。因此本研究建立急性高眼壓大鼠模型，采用雷公藤甲素干預(yù)后觀察實(shí)驗(yàn)動物的RGCs 情況，探討雷公藤甲素治療青光眼的潛在可能性。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

雷公藤甲素（中國藥品生物制品檢定所）；TUNEL原位凋亡試劑盒（瑞士羅氏公司，批號：116848）；免疫熒光染色試劑盒（北京愛必信公司，批號：abs50013）；兔抗大鼠Caspase-3 抗體（美國Bioworld 公司，批號：CJ44121）；XDS-1B 型倒置顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠）；石蠟組織切片機(jī)（德國LEICA 公司，RM2235）；圖像采集系統(tǒng)（德國萊卡公司，DM5500 B）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及分組

健康清潔級成年Wister 大鼠60 只，雌雄各半，體重（200±20）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號SCXK（京）2017-0016。實(shí)驗(yàn)動物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

采用隨機(jī)數(shù)字表法將60 只大鼠分為對照組、模型組、雷公藤甲素組，每組20 只。對照組不做任何處理，模型組和雷公藤甲素組大鼠右眼均制備急性高眼壓模型。造模后雷公藤甲素組每日腹腔注射10 μg/kg雷公藤甲素，對照組和模型組注射等量的生理鹽水，共注射7 d。

1.3 動物模型的建立

以戊巴比妥鈉麻醉動物，依據(jù)參考文獻(xiàn)[9]方法，于結(jié)膜囊內(nèi)滴丁卡因眼藥水眼表麻醉5 min，5 號靜脈輸液針頭前房穿刺，然后升高輸液瓶，調(diào)節(jié)輸液器高度以控制壓力（110 mmHg）（1 mmHg=0.133 kPa），維持1 h，緩慢降低輸液瓶高度與動物水平，測量眼壓，>22 mmHg 即為急性高眼壓損傷建模成功。

1.4 取材及標(biāo)本制備

連續(xù)藥物腹腔注射7 d 后，將大鼠麻醉處死，快速摘取右眼眼球，留取部分球后視神經(jīng)組織，4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，用于后續(xù)HE、TUNEL 法、免疫熒光染色觀察。

1.5 HE 染色觀察三組視網(wǎng)膜改變

將視網(wǎng)膜置于4%多聚甲醛中固定，石蠟浸蠟，常規(guī)包埋，4 μm 連續(xù)矢狀切片，常規(guī)HE 染色[10]，顯微鏡觀察。采用Image Pro Plus 5.1 軟件測量視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層（retinal nerve fiber layer，RNFL）厚度。

1.6 TUNEL 法染色觀察RGCs 凋亡情況

將“1.4”中石蠟包埋組織切片常規(guī)脫臘，參照TUNEL 試劑盒說明書操作，玻片干后，用抗熒光衰減封片劑封片，風(fēng)干，熒光顯微鏡下觀察并拍照[11]。觀察各組RGCs 的凋亡情況。

1.7 免疫熒光法觀察存活RGCs

依據(jù)參考文獻(xiàn)[12]，將視網(wǎng)膜置于4%多聚甲醛中固定1 h，PBST 漂洗3 次，驢血清封閉1 h 后加入βⅢTubulin 一抗（1∶100），4℃孵育過夜，PBS 漂洗3 次，每次10 min，加入相應(yīng)Cy3（1∶100）二抗，于室溫下避光孵育2 h，PBS 漂洗后封片，熒光顯微鏡下觀察，參考文獻(xiàn)[4]的方法，計(jì)算存活RGCs 數(shù)。

1.8 免疫組化檢測三組視網(wǎng)膜中Caspase-3 表達(dá)

制備的石蠟切片常規(guī)脫蠟，水浴加熱修復(fù)，滴加H2O2溶液使內(nèi)源性過氧化物酶失活，每片滴加Caspase-3（1∶100）一抗，4℃過夜，滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（1∶100），置于37℃孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復(fù)染。Caspase-3 陽性表達(dá)為細(xì)胞核呈棕黃色，光學(xué)顯微鏡下對陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE 染色觀察視網(wǎng)膜病理學(xué)改變

對照組視網(wǎng)膜各層次排列規(guī)整，RGCs 排列緊密，細(xì)胞核邊界清楚，呈卵圓形或圓形；模型組視網(wǎng)膜全層、神經(jīng)纖維層和內(nèi)外顆粒層均增厚、RGCs 減少，視網(wǎng)膜萎縮；雷公藤甲素組視網(wǎng)膜各層次清晰，排列整齊。見圖1。

圖1 三組視網(wǎng)膜組織病理學(xué)改變（HE 染色，200×）

2.2 三組RNFL 厚度值變化

對照組、模型組和雷公藤甲素組的RNEL 平均厚度分別為：（33.42±1.53）μm、（58.14±1.71）μm、（50.23±2.35）μm。三組RNFL 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=886.417，P ＜0.05）。模型組RNEL 厚度值高于對照組，雷公藤甲素組RNEL 厚度值低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=41.224、13.191，均P ＜0.05）。

2.3 三組RGCs 凋亡情況比較

TUNEL 法染色觀察到凋亡RGCs 染色呈綠色熒光，見圖2。對照組、模型組和雷公藤甲素組凋亡RGCs數(shù)分別為：（7.02±2.80）個/視野、（28.50±6.85）個/視野、（14.35±2.69）個/視野。三組凋亡RGCs 數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=115.380，P ＜0.05）。模型組凋亡RGCs 數(shù)高于對照組，雷公藤甲素組凋亡RGCs數(shù)低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.942、9.843均P ＜0.05）。

圖2 三組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡情況（TUNEL 法染色，200×）

2.4 三組RGCs 存活情況

免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn)，對照組和雷公藤甲素組RGCs 及神經(jīng)纖維排列整齊；模型組RGCs 及神經(jīng)纖維排列混亂，見圖3。對照組、模型組和雷公藤甲素組存活RGCs 數(shù)分別為：（2310.20±152.30）個/0.235 mm2、（1351.50±96.61）個/0.235 mm2、（1644.43±72.67）個/0.235 mm2。三組存活RGCs 數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=383.014，P ＜0.05）。模型組存活RGCs 數(shù)少于對照組，雷公藤甲素組存活RGCs 數(shù)高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=27.005、8.251，均P ＜0.05）。

圖3 三組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活情況（免疫熒光染色，200×）

2.5 三組Caspase-3 陽性細(xì)胞數(shù)比較

免疫組化法觀察發(fā)現(xiàn)，Caspase-3 陽性表達(dá)為細(xì)胞核呈棕黃色。見圖4（封四）。對照組、模型組、雷公藤甲素組Caspase-3 陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為（1.3±0.2）個/視野、（29.7±4.6）個/視野、（10.1±2.3）個/視野。三組Caspase-3 陽性細(xì)胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=478.732，P ＜0.05）。模型組Caspase-3 陽性細(xì)胞數(shù)高于對照組，雷公藤甲素組Caspase-3 陽性細(xì)胞數(shù)低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=30.223、20.858，均P ＜0.05）。

圖4 三組Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)比較(免疫組化染色,200x)

3 討論

青光眼是全球僅次于白內(nèi)障的第二大致盲眼病，且青光眼早期不易發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)時就已有嚴(yán)重的視神經(jīng)損害[13]。鼠眼結(jié)構(gòu)與人類類似，具有完備的房角系統(tǒng)，其高眼壓模型能夠模擬人青光眼視網(wǎng)膜神經(jīng)損傷的病理過程[14]。雷公藤甲素是中藥雷公藤的有效提取成分，具有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤等多種藥理活性[15-17]。文獻(xiàn)報(bào)道[18]，雷公藤甲素能減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠皮層的病理改變，減少細(xì)胞凋亡，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組視網(wǎng)膜全層、神經(jīng)纖維層和內(nèi)外顆粒層均增厚，RGCs 減少，視網(wǎng)膜萎縮，提示急性高眼壓造模成功。雷公藤甲素組與模型組比較，視網(wǎng)膜損傷減輕，RNFL 厚度值降低，提示雷公藤甲素對急性高眼壓有防治作用。

研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞在青光眼的視神經(jīng)損傷過程中扮演重要角色[19]。抑制小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化能夠有效減輕視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷，促進(jìn)視覺功能恢復(fù)[20]。還有研究表明[21]，在青光眼視覺傳導(dǎo)通路上，神經(jīng)軸突的損傷狀態(tài)與小膠質(zhì)細(xì)胞的活化程度完全一致。本研究顯示，雷公藤甲素組與模型組比較，凋亡RGCs 數(shù)減少，存活RGCs 數(shù)升高。這些結(jié)果提示雷公藤甲素能促進(jìn)RGCs 存活，對RGCs 具有保護(hù)作用，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究，推測雷公藤甲素對小膠質(zhì)細(xì)胞的增生和活化的抑制作用可能是原因之一。

研究報(bào)道[22]，RGCs 凋亡與細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因表達(dá)有關(guān)。Caspase 是一類死亡特異性蛋白酶家族[23]，Caspase-3 是凋亡級聯(lián)反應(yīng)的最終效應(yīng)蛋白，被認(rèn)為是凋亡的執(zhí)行器之一，也是青光眼RCGs 死亡過程中重要的細(xì)胞信號途徑之一[24-25]。本研究中TUNEL及免疫熒光觀察結(jié)果提示雷公藤甲素可能通過下調(diào)Caspase -3 在RGCs 中的表達(dá)，減少RGCs 凋亡。

綜上所述，雷公藤甲素可能通過抑制Caspase-3表達(dá)，增加急性高眼壓大鼠模型中RGCs 數(shù)量，同時還推測雷公藤甲素可能通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的增生和活化實(shí)現(xiàn)對RGCs 的保護(hù)作用，下一步將對其進(jìn)行深入研究，為青光眼的治療提供新思路。