李竹英 陳 璐 袁星星 王 婷 張 玉 連夢(mèng)堯 李 星

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科，黑龍江哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，黑龍江哈爾濱 150040；3.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161000

支氣管哮喘（以下簡(jiǎn)稱“哮喘”）是一種慢性氣道炎癥性疾病，因其不斷增長(zhǎng)的發(fā)病率和死亡率而備受世界關(guān)注。中國(guó)肺健康研究顯示，目前我國(guó)哮喘患病人數(shù)約4570 萬(wàn)，總體發(fā)病率達(dá)4.2%[1]。西醫(yī)治療哮喘最有效的藥物為糖皮質(zhì)激素，雖然其具有較強(qiáng)的抗炎作用，但是長(zhǎng)期服用會(huì)造成口咽念珠菌感染、聲音嘶啞等副作用，給患者帶來(lái)較大的心理負(fù)擔(dān)。近年來(lái)，中藥治療哮喘越來(lái)越受到重視，具有藥性溫和、藥效持久、副作用小、成本低廉等優(yōu)勢(shì)。

黃芪顆粒、黃芪注射液及黃芪類復(fù)方對(duì)哮喘的治療有積極的作用，可以提高患者的臨床控制率，減輕氣道炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，改善肺功能[2-4]。黃芪味甘性微溫，歸脾、肺經(jīng)，有補(bǔ)氣健脾、益衛(wèi)固表之效?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，黃芪具有興奮呼吸中樞、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗缺氧、提高機(jī)體的抗病力等作用。已有數(shù)據(jù)表明，黃芪的化學(xué)成分可通過(guò)調(diào)控相關(guān)的炎癥因子及基因蛋白等途徑發(fā)揮治療哮喘的作用[5-6]。但目前的研究多從單一成分或單一靶點(diǎn)對(duì)黃芪治療哮喘的機(jī)制進(jìn)行探討，很難闡明中藥治療疾病的整體性與系統(tǒng)性。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，從多維度探究黃芪治療哮喘的活性成分、作用靶點(diǎn)和相關(guān)通路，為黃芪治療哮喘機(jī)制的系統(tǒng)研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 黃芪活性成分及靶點(diǎn)獲取

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）輸入“黃芪”檢索其化學(xué)成分，再根據(jù)口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 的標(biāo)準(zhǔn)篩選出符合條件的活性化學(xué)成分[7]。然后在TCMSP 中，利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（Uniprot）篩選出黃芪中的活性化學(xué)成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白基因名，重復(fù)靶點(diǎn)僅保留1 個(gè)，所得靶點(diǎn)即為黃芪活性化學(xué)成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

1.2 哮喘相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

以“asthma”為檢索詞從Genecards 網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)庫(kù)中檢索哮喘的相關(guān)靶點(diǎn)。同時(shí)將黃芪活性化學(xué)成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與哮喘的相關(guān)靶點(diǎn)在Venny 2.1.0 中映射篩選出共同靶點(diǎn)，即為黃芪作用于哮喘的潛在靶點(diǎn)。

1.3 黃芪-化合物-靶點(diǎn)-哮喘網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將黃芪活性化合物及“1.2”中獲取的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0 中，構(gòu)建黃芪-化合物-靶點(diǎn)-哮喘網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)計(jì)算節(jié)點(diǎn)的度值（degree）來(lái)篩選關(guān)鍵化合物。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將“1.2”中獲取的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取PPI 數(shù)據(jù)，將PPI 數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0 中構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 基因本體論（GO）功能富集分析及日本京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

基于R 語(yǔ)言軟件，利用Bioconductor 生物信息軟件包對(duì)黃芪作用于哮喘的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析，通過(guò)R 語(yǔ)言中“Cluster profiler”進(jìn)行可視化處理，設(shè)定閾值P ＜0.05 為指標(biāo)進(jìn)行篩選，選取P 值由小到大前20 條目制圖。

2 結(jié)果

2.1 黃芪活性成分及靶點(diǎn)篩選結(jié)果

從TCMSP 平臺(tái)中搜索符合標(biāo)準(zhǔn)的黃芪活性化合物19 個(gè)。見(jiàn)表1。將所獲得的活性化合物對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白名導(dǎo)入U(xiǎn)niprot 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化，刪除重復(fù)項(xiàng)，共得到黃芪活性化合物的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)97 個(gè)。

表1 黃芪活性化合物信息

2.2 哮喘相關(guān)靶點(diǎn)的獲取結(jié)果

在Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到哮喘相關(guān)靶點(diǎn)5973 個(gè)，將97 個(gè)黃芪活性化合物的預(yù)測(cè)靶與哮喘相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，取二者交集得到共同靶點(diǎn)81 個(gè)。見(jiàn)圖1。

圖1 哮喘相關(guān)靶點(diǎn)與黃芪活性化合物的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 黃芪-化合物-靶點(diǎn)-哮喘網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

網(wǎng)絡(luò)中共有96 個(gè)節(jié)點(diǎn)和272 條邊，見(jiàn)圖2。靶點(diǎn)數(shù)較多的前5 位化合物依次為槲皮素（65 個(gè)）、山奈酚（29 個(gè)）、異鼠李素（15 個(gè)）、刺芒柄花素（13 個(gè)）、毛蕊異黃酮（10 個(gè)），其可能是黃芪發(fā)揮治療哮喘作用的關(guān)鍵化合物。

圖2 黃芪-化合物-靶點(diǎn)-哮喘網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

為進(jìn)一步研究黃芪治療哮喘的作用機(jī)制，將映射所得81 個(gè)共同靶點(diǎn)進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析并進(jìn)行可視化處理，網(wǎng)絡(luò)圖中包括18 個(gè)節(jié)點(diǎn)，89 條邊，圖中節(jié)點(diǎn)的大小表示靶點(diǎn)的degree 值，顏色由黃色到紫色，表示靶點(diǎn)的度值由小到大，見(jiàn)圖3（封三）。絲裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、白細(xì)胞介素（IL）-6、細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、MYC 的degree 值排名靠前，可能是黃芪發(fā)揮中醫(yī)臨床功效及與哮喘產(chǎn)生關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

圖3 黃芪和哮喘共同靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析結(jié)果

將上述81 個(gè)潛在靶點(diǎn)經(jīng)R 語(yǔ)言運(yùn)行后可得到GO 功能富集分析110 個(gè)條目（P ＜0.05），按照P 值從小到大順序排列，排名前20 的GO 條目繪制成氣泡圖，氣泡節(jié)點(diǎn)越大則富集基因數(shù)目越多，顏色越紅則富集越顯著，見(jiàn)圖4（封三），其中在DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性、RNA 聚合酶Ⅱ特異性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、氧化還原酶活性、激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等方面靶點(diǎn)富集較集中。

圖4 基因本體論功能富集分析

KEGG 通路富集分析篩選得到119 條通路（P ＜0.05），按照P 值從小到大順序排列，排名前20 的通路繪制成柱狀圖，柱狀圖長(zhǎng)度越長(zhǎng)則富集基因數(shù)目越多，顏色越紅則富集越顯著，見(jiàn)圖5（封四），其中黃芪治療哮喘的主要信號(hào)通路為AGE-RAGE 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路和p53 信號(hào)通路。

圖5 日本京都基因和基因組百科全書通路富集分析

3 討論

本研究篩選出黃芪治療哮喘的主要活性成分為槲皮素、山柰酚、異鼠李素、刺芒柄花素、毛蕊異黃酮。其中槲皮素可以通過(guò)抑制氣道炎癥、降低氣道高反應(yīng)性和免疫調(diào)節(jié)等多種途徑對(duì)哮喘起到明顯的治療作用。Luo 等[8]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可以通過(guò)抑制IL-6、IL-1β和TNF-α 等炎癥因子的表達(dá)減輕氣道炎癥反應(yīng)，緩解哮喘小鼠的癥狀。山柰酚可以抑制哮喘氣道重塑重要靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）mRNA 的表達(dá)[9]。異鼠李素能夠通過(guò)抑制樹突細(xì)胞（DCs）表面共刺激分子的表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫能力和減輕炎癥反應(yīng)[10]。刺芒柄花素可以減輕炎癥反應(yīng)、抗氧化及調(diào)節(jié)免疫機(jī)制，能夠通過(guò)促進(jìn)相關(guān)免疫器官免疫活性細(xì)胞的增殖和成熟來(lái)增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能[11]。毛蕊異黃酮可以抑制過(guò)敏性炎癥的早期反應(yīng)，其機(jī)制可能與降低核因子κB（NF-κB）轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而減少胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素的生成有關(guān)[12]。由此可見(jiàn)黃芪中的主要活性成分具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等功能，對(duì)哮喘引發(fā)的炎癥反應(yīng)及氣道重塑具有潛在的治療作用。

通過(guò)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析篩選degree 值前6 位的靶點(diǎn)依次為：MAPK8、EGFR、IL-6、Cyclin D1、VEGF、MYC，可能為黃芪發(fā)揮中醫(yī)臨床功效及與哮喘產(chǎn)生關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。MAPK8 是MAPK 家族成員之一，MAPK 信號(hào)通路可以通過(guò)介導(dǎo)炎癥、免疫應(yīng)答、氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞反應(yīng)等途徑參與哮喘的發(fā)生和發(fā)展[13]。EGFR 能夠與表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等配體結(jié)合，促進(jìn)上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖、分化，從而致使氣道上皮組織損傷和氣道重塑，加重哮喘的病情[14]。IL-6 是哮喘的重要促炎性細(xì)胞因子，能夠刺激Th2 細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等釋放多種炎癥介質(zhì)，誘發(fā)哮喘患者氣道炎癥，加重哮喘癥狀[15]。VEGF 能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)氣道血管擴(kuò)張和通透性增強(qiáng)，促使支氣管周圍纖維化，加重哮喘氣道重塑[16]。研究證實(shí)，Cyclin D1 和MYC 基因均能夠促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞的增殖力，兩者在哮喘大鼠肺組織中的表達(dá)水平與氣道重塑程度呈正相關(guān)[17-18]。

GO 功能富集分析發(fā)現(xiàn)，黃芪治療哮喘的潛在靶點(diǎn)主要涉及DNA 和RNA 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞因子與轉(zhuǎn)錄因子的活性及受體結(jié)合、抗氧化應(yīng)激、激素調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)結(jié)合和酶活性等生物學(xué)功能。通過(guò)KEGG 富集分析并查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)黃芪可以通過(guò)調(diào)控多條信號(hào)通路達(dá)到治療哮喘的目的。其中AGE-RAGE 信號(hào)通路能夠磷酸化NF-κB，促進(jìn)大量黏附分子、生長(zhǎng)因子、炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)和釋放，引發(fā)氣道炎癥反應(yīng)[19]。AGE-RAGE 信號(hào)通路可以通過(guò)激活蛋白激酶C 增強(qiáng)TGF-β1 的表達(dá)，致細(xì)胞外基質(zhì)的沉積及氣道上皮間質(zhì)化，最終導(dǎo)致氣道重塑[20-21]。TNF 信號(hào)通路是哮喘發(fā)病過(guò)程中的重要通路，能夠促使中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞聚集于氣道產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，調(diào)控支氣管平滑肌細(xì)胞增殖分化和增加血管通透性參與氣道重塑，并刺激G 蛋白偶聯(lián)受體、內(nèi)皮素受體的表達(dá)引發(fā)氣道高反應(yīng)性[22]。PI3K/Akt 信號(hào)通路與哮喘氣道重塑關(guān)系密切，可促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞增殖，造成氣道壁增厚和管腔狹窄[23]。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt 信號(hào)通路可調(diào)控Th1/Th2，促進(jìn)Th2 細(xì)胞炎癥因子的分泌，引發(fā)哮喘的氣道炎癥反應(yīng)及氣道高反應(yīng)性[24]。嗜酸性粒細(xì)胞的凋亡過(guò)程主要由細(xì)胞抗凋亡基因（Bcl 基因家族）調(diào)控，p53 信號(hào)通路可以激活線粒體上的Bax 基因，使其與Bcl-2 結(jié)合而解除Bcl-2 抑制細(xì)胞凋亡的作用，從而誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡，控制哮喘的炎癥反應(yīng)[25]。以上的研究結(jié)果與本研究的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果較為一致，進(jìn)一步印證了黃芪治療哮喘的作用機(jī)制。

綜上所述，黃芪的主要活性成分可通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮對(duì)哮喘的治療作用。黃芪中槲皮素、山柰酚、異鼠李素、刺芒柄花素、毛蕊異黃酮通過(guò)調(diào)控AGERAGE 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路和p53 信號(hào)通路作用于MAPK8、EGFR、IL-6、Cyclin D1、VEGF、MYC 等靶點(diǎn)，發(fā)揮抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用，對(duì)哮喘所引發(fā)的炎癥反應(yīng)、氣道高反應(yīng)性及氣道重塑發(fā)揮治療作用。鑒于本研究?jī)H是通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘的形式對(duì)黃芪治療哮喘的作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)，數(shù)據(jù)庫(kù)尚未能收錄所有的化學(xué)成分，可能會(huì)造成部分特異性化合物信息丟失，故存在一定的局限性，后期還需要更加深入的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)予以佐證。