曹良國 姚依村 葉冬平 梁偉國 王文

廣州市紅十字會醫(yī)院骨科 510000

下腰痛是一種常見且經(jīng)常復(fù)發(fā)的肌肉骨骼疾病，在全球范圍內(nèi)造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1-2］。椎間盤（IVD）退變被認(rèn)為是下腰痛的主要原因，因此了解IVD的病理生理學(xué)具有重要意義［3］。越來越多的證據(jù)表明，機(jī)械應(yīng)力，包括流體剪切力（FSS）、靜水壓、壓縮應(yīng)力、拉伸應(yīng)力和其他機(jī)械應(yīng)力，在椎間盤的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［4］。為了保持直立姿勢，椎間盤受到壓縮應(yīng)力，可引起髓核（NP）變形并產(chǎn)生靜水壓。然后將靜水壓轉(zhuǎn)移至纖維環(huán)（AF），并誘導(dǎo)產(chǎn)生拉伸應(yīng)力。在身體運動和脊柱運動過程中，NP內(nèi)的組織液進(jìn)出以適應(yīng)這些應(yīng)力的變化。因此，NP細(xì)胞持續(xù)暴露于FSS。然而，F(xiàn)SS是否能夠以及如何調(diào)節(jié)NP細(xì)胞的ECM穩(wěn)態(tài)還知之甚少。

自噬是一種高度保守的適應(yīng)性過程，涉及選擇性消除和回收大量有害細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)，如錯誤折疊的蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器，從而作為維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的主要細(xì)胞保護(hù)系統(tǒng)［5-6］。通常，細(xì)胞表現(xiàn)出較低和基礎(chǔ)水平的自噬。但是，自噬水平可顯著增加，以應(yīng)對外部環(huán)境應(yīng)激，包括機(jī)械應(yīng)激和營養(yǎng)剝奪，為基本細(xì)胞功能提供營養(yǎng)［7］。血紅素加氧酶-1（HO-1）已在許多組織和器官以及不同的病理生理學(xué)情景中被確定，是血紅素代謝為膽綠素、一氧化碳和鐵的限速酶，可對各種外部環(huán)境應(yīng)激誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，炎癥和細(xì)胞死亡［8-9］。本研究中探究FSS對調(diào)節(jié)HO-1表達(dá)及髓核細(xì)胞自噬作用和ECM的影響。

1 材料與方法

1.1 NP細(xì)胞系培養(yǎng)及FSS實驗 本研究中使用永生化大鼠NP細(xì)胞系。細(xì)胞在補(bǔ)充1%青霉素-鏈霉素的含10%FBS的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基中于37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)。如前所述進(jìn)行FSS實驗。將細(xì)胞以3.0×104/cm2的密度接種到Ⅰ型膠原包被的培養(yǎng)玻片（75 mm×25 mm×1 mm；FFCS-C；Flexcell，美國）上，并在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到85%融合時，將玻片置于Streamer?系統(tǒng)（STR-4000；Flexcell，美國），細(xì)胞暴露于12或24 dyne/cm2FSS0、1、2、3和4 h。NP細(xì)胞在暴露于FSS前用10μm鈷原卟啉（CoPP，Sigma，C1900，美國）預(yù)處理1 h或用500 nm雷帕霉素（Selleck，S1039，美國）預(yù)處理12 h。

1.2 RNA測序分析 使用TransZol Up Plus RNA試劑盒（ER501-01；Transgen，中國）從有或無FSS刺激的NP細(xì)胞中分離總RNA，每份樣品3μg RNA用作RNA樣品制備的輸入材料。使用NEBNext?UltraTM RNA文庫制備試劑盒（Illunina，NEB，美國）生成測序文庫，并在Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)上評估文庫質(zhì)量。簇生成后，在Illumina Hiseq平臺上對文庫制備物進(jìn)行測序，生成150 bp配對末端讀取。質(zhì)量控制、reads映射到參考基因組并定量基因表達(dá)水平后，采用DESeq2 R包（1.16.1）進(jìn)行差異表達(dá)分析，采用cluster Profiler R包進(jìn)行基因本體（GO）和京東基因與基因組大百科全書（KEGG）富集分析。RNASeq數(shù)據(jù)已保存在序列讀取檔案（SRA，PRJNA587407）中。

1.3 硫酸化糖胺聚糖（sGAG）含量分析 4%多聚甲醛固定后，NP細(xì)胞經(jīng)不同濃度乙醇和二甲苯脫水。然后用阿利新藍(lán)對細(xì)胞進(jìn)行染色。為測定sGAG含量，用木瓜蛋白酶提取試劑消化細(xì)胞，然后通過Blyscan SGAG測定法（B1000；Biocolor，英國）定量測定sGAG含量。

1.4 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）分析 使用Tripure分離試劑（11667165001，Roche，德國）從NP細(xì)胞中提取總RNA。進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄（RT）和qRT-PCR分析。根據(jù)生產(chǎn)商的方案，使用PrimeScriptTM RT Master Mix（RR036A，Takara，日本）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄后，使用iTaqTM Universal SYBR?Green Supermix（172-5121，Bio-Rad）進(jìn)行qRT-PCR。采用2-ΔΔCT法分析數(shù)據(jù)，GAPDH作為內(nèi)對照。

1.5 免疫印跡分析髓核細(xì)胞用三純分離試劑（11667165001，德國羅氏）裂解。在4℃下12 000×g離心10 min后，用乙醇沉淀法從下層紅色有機(jī)相中分離出蛋白質(zhì)顆粒。用0.3M鹽酸胍/95%乙醇洗滌蛋白顆粒3次，加入1%十二烷基硫酸鈉溶解蛋白顆粒。用PierceTM BCA蛋白分析試劑盒（23225，Thermo Fisher Science，美國）檢測蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)負(fù)載于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳。蛋白轉(zhuǎn)移后，用5%脫脂牛奶封閉膜，然后與抗Col2a1抗體（1∶1 000，A1560；Abclon Technology，中國）、Aggrecan（1∶1 000，ab36861；Abcam，英 國）、MMP13（1∶3 000，ab39012；Abcam，英國）、ADAMTS5（1∶500，ab41037；Abcam，英國）、HO-1（1∶1 000，ab39012；Abcam，英國）在4℃孵育過夜。IFT88（1∶500，13967-1-AP；Proteintech，中國）和GAPDH（1∶2 000，TA-08；ZSGB-Bio，中國）。用TBST洗滌3次后，在室溫下與二次抗體孵育1 h。最后采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法對蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測。

1.6 免疫熒光 細(xì)胞在4%多聚甲醛中室溫固定10 min后，在0.1%Triton-100中通透15 min，室溫下用1%牛血清白蛋白阻斷1 h。隨后，細(xì)胞與抗HO-1抗體（1∶200，10701-1-AP；Proteintech，中國）和乙?；⒐艿鞍祝?∶400，T6793；Sigma，美國）在4℃下孵育過夜，然后與AlexaFluor488偶聯(lián)的兔和小鼠二抗（1∶500，A11008和A11001，Thermo Fisher Science，美國）在室溫下孵育1 h。DAPI染色后，用共聚焦顯微鏡（A1R，尼康，日本）觀察細(xì)胞，并用ImageJ軟件（1.50版，美國國立衛(wèi)生研究院）進(jìn)行分析。

1.7 纖毛長度和患病率測量 使用Nikon A1R共聚焦顯微鏡（油浸×100物鏡）創(chuàng)建共聚焦z堆棧的最大投影，根據(jù)該投影通過ImageJ軟件測量纖毛長度。同時采用共聚焦z最大投影測定纖毛患病率和DAPI核染色。

1.8 小干擾RNA（siRNA）的轉(zhuǎn)染 分別用陰性對照（NC）siRNA和3個獨立的HO-1-siRNAs和IFT88-siRNAs轉(zhuǎn)染NP細(xì)胞。使用HO-1-siRNA（#2）和IFT88-siRNA（#1）的最有效靶序列。用Lipofectamine TMRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑（13778150；Thermo Fisher Science，美國）將siRNA以50 pmol/105cell轉(zhuǎn)染細(xì)胞。24 h后，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞消化后接種于Ⅰ型膠原包被的培養(yǎng)片上進(jìn)行進(jìn)一步研究。

1.9 透射電子顯微鏡（TEM）收獲的NP細(xì)胞在PBS和去離子水中清洗，然后通過離心沉淀。細(xì)胞分別用2.5%戊二醛固定2 h，1%四氧化鋨固定2 h。然后將細(xì)胞在乙醇中脫水，浸潤并包埋在Embed 812中。超薄切片用UranyLess（22409；EMS，英國）和檸檬酸鉛（22410；EMS，英國）染色，并用TEM（HT7700；Hitachi，日本）檢查。

1.10 使用mRFP-GFP-LC3慢病毒載體進(jìn)行自噬檢測 NP細(xì)胞接種于24孔板（1×105/板）。24 h后按廠家說明書用慢病毒載體（武漢惠爾生物科技有限公司）感染細(xì)胞。感染后48 h，嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)mRFP-GFP-LC3的NP細(xì)胞系。然后將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用于自噬檢測。通過共聚焦顯微鏡（A1R；Nikon，日本）測定自噬。通過評價GFP和mRFPpuncta的數(shù)量檢測自噬通量。自由紅點表示自噬溶酶體，黃點表示自噬體。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析 使用GraphPad Prism 6軟件（GraphPad software Inc，美國）進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有實驗均至少進(jìn)行3次獨立實驗，符合正態(tài)分布的計數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用獨立樣本t檢驗分析兩組參數(shù)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 FSS調(diào)節(jié)大鼠NP細(xì)胞ECM蛋白表達(dá)和sGAG含量 作為探索機(jī)械力調(diào)節(jié)IVD穩(wěn)態(tài)機(jī)制的初始步驟，我們進(jìn)行了實驗以確定FSS對大鼠NP細(xì)胞的ECM蛋白表達(dá)的影響，見圖1。NP細(xì)胞以12 dyne/cm2的劑量在指定時間進(jìn)行FSS處理（圖1B），然后測定sGAG含量和幾種關(guān)鍵ECM蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，F(xiàn)SS處理1、2 h時sGAG含量和聚集蛋白聚糖蛋白水平顯著升高，F(xiàn)SS處理1、2和3 h時MMP13蛋白水平顯著降低（圖1C、D、E、G、H）。FSS處 理 使Col2a1表 達(dá)輕度增加，ADAMTS5表達(dá)降低（圖1F、I）。然而，當(dāng)NP細(xì)胞暴露于24 dyne/cm2FSS處理時，sGAG含量和Col2a1和聚集蛋白聚糖的蛋白水平降低，而MMP13和ADAMTS5的水平呈時間依賴性升高。提示中度FSS上調(diào)NP細(xì)胞sGAG含量和合成代謝ECM蛋白（Col2a1和聚集蛋白聚糖），下調(diào)分解代謝ECM蛋白（MMP13和ADAMTS5），而高FSS發(fā)揮相反的作用。我們接下來的研究重點是確定中度FSS（即12 dyne/cm2處理2 h）調(diào)節(jié)NP細(xì)胞中關(guān)鍵ECM蛋白表達(dá)和sGAG含量的潛在機(jī)制。

圖1 FSS調(diào)節(jié)NP細(xì)胞的ECM的表達(dá)和sGAG含量（A為NP細(xì)胞FSS的形成，顯示了C、HP和T。B為Flexcell Streamer系統(tǒng)示意圖。C為阿利新藍(lán)染色，NP房間與12 dyne/cm2 FSS在指定時間被對待；條形，100μm。D為sGAG含量，NP細(xì)胞按圖B處理，然后進(jìn)行Blyscan SGAG試驗。E～I(xiàn)為Western blotting；NP細(xì)胞按圖C處理，然后進(jìn)行Col2a1、聚集蛋白聚糖、MMP13和ADAMTS5表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析）

2.2 HO-1在NP細(xì)胞中被中度FSS大量上調(diào) 為了鑒定受中度FSS處理調(diào)控的基因，用或不用FSS（12 dyne/cm2處 理NP細(xì)胞2 h）處理NP細(xì)胞。分離兩組的總RNA，并按照材料和方法中的描述進(jìn)行RNA測序分析。在上調(diào)的基因中，我們發(fā)現(xiàn)FSS處理顯著上調(diào)HO-1，P值最低（圖2A、B）。qRT-PCR分析、western blotting和免疫熒光染色結(jié)果進(jìn)一步驗證了FSS處理使HO-1 mRNA和蛋白的水平急劇升高（圖2C～G）。

2.3 HO-1是NP細(xì)胞ECM中度FSS調(diào)節(jié)的關(guān)鍵 我們接下來確定HO-1是否參與NP細(xì)胞ECM蛋白的FSS調(diào)節(jié)。為此，用陰性對照siRNA（NC-siRNA）和3種不同的HO-1 siRNA（#1、#2和#3）轉(zhuǎn)染NP細(xì)胞。在本研究中，我們選擇了#2 HO-1 siRNA進(jìn)行HO-1敲低，因為#2 HO-1 siRNA表現(xiàn)出最佳的敲低效率（圖2H、I）。為了確定HO-1是否參與FSS對ECM的調(diào)節(jié)，首先用對照siRNA或HO-1-siRNA（#2）轉(zhuǎn)染NP細(xì)胞。然后，用或不用HO-1誘導(dǎo)劑鈷原卟啉IX（CoPP）（10μm）預(yù)處理細(xì)胞1 h，用12 dyne/cm2FSS預(yù)處理細(xì)胞2 h。正如預(yù)期的那樣，HO-1 siRNA顯著降低HO-1蛋白的水平，CoPP處理可顯著逆轉(zhuǎn)HO-1蛋白的水平（圖2J、K）。此外，HO-1 siRNA顯著減少了sGAG的合成，CoPP處理可部分逆轉(zhuǎn)sGAG的合成（圖2L、M）。同樣，蛋白免疫印跡分析結(jié)果顯示HO-1 siRNA下調(diào)合成代謝ECM蛋白（Col2a1和聚集蛋白聚糖）的水平，上調(diào)分解代謝ECM蛋白（MMP13和ADAMTS5）的水平，CoPP處理可逆轉(zhuǎn)這種作用（圖2N～R）。

2.4 FSS促進(jìn)NP細(xì)胞自噬 我們確定FSS是否激活NP細(xì)胞的自噬。結(jié)果顯示，與未處理的細(xì)胞相比，用FSS處理的NP細(xì)胞表現(xiàn)出自噬增加，表現(xiàn)為LC3-II/LC3-I比值和Beclin-1蛋白水平的急劇增加（圖3A～C）。同樣，TEM分析顯示，與未處理細(xì)胞相比，F(xiàn)SS處理細(xì)胞中自噬體和自噬溶酶體的數(shù)量顯著增加（圖3D）。此外，免疫熒光共聚焦顯微鏡分析顯示，與未處理的細(xì)胞相比，F(xiàn)SS處理的NP細(xì)胞中自噬體（黃點）和自噬溶酶體（游離紅點）的數(shù)量均顯著增加（圖3E、F）。

2.5 HO-1調(diào)節(jié)FSS誘導(dǎo)的NP細(xì)胞自噬 我們接下來確定HO-1是否在介導(dǎo)FSS誘導(dǎo)的NP細(xì)胞自噬中發(fā)揮作用。NP與FSS被對待，有或沒有CoPP處理，在有或沒有HO-1敲低siRNA。結(jié)果顯示，HO-1敲低顯著降低了FSS處理誘導(dǎo)的NP細(xì)胞LC3-II/LC3-I比值和Beclin-1表達(dá)的增加，CoPP處理可顯著逆轉(zhuǎn)該作用（圖3G～I(xiàn)）。TEM分析顯示，與對照siRNA/FSS處理的細(xì)胞相比，HO-1 siRNA顯著減少了FSS處理的NP細(xì)胞中自噬體和自噬溶酶體的數(shù)量，CoPP處理可在很大程度上逆轉(zhuǎn)這種情況（圖3J）。同樣，免疫熒光共聚焦顯微鏡分析顯示，與對照siRNA/FSS處理的細(xì)胞相比，HO-1 siRNA/FSS處理的NP細(xì)胞中自噬體（黃點）和自噬溶酶體（游離紅點）的數(shù)量均急劇下降，CoPP處理可逆轉(zhuǎn)這種情況（圖3K、L）。

圖2 HO-1調(diào)節(jié)FSS介導(dǎo)的NP細(xì)胞內(nèi)ECM的產(chǎn)生[A為RNA-SEQ數(shù)據(jù)熱圖。NP細(xì)胞用或不用12 dyne/cm2 FSS處理2 h，然后進(jìn)行RNA-seq分析，如“材料與方法”中所述。B為RNA-SEQ數(shù)據(jù)的火山圖。藍(lán)色箭頭表示血紅素加氧酶-1(HO-1)。C為實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)分析。NP細(xì)胞經(jīng)12 dyne/cm2 FSS作用2 h后，進(jìn)行qRT-PCR分析。D、E為Western blotting。NP細(xì)胞按C組處理，然后進(jìn)行Western blotting。來自3個獨立實驗的定量數(shù)據(jù)（E）。F、G為免疫熒光（IF）染色。NP細(xì)胞按組（C）處理，免疫熒光染色（E），F(xiàn)放大倍數(shù)為400倍BAR，50μm。來自3個獨立實驗的定量數(shù)據(jù)（G）。H、I為HO-1 siRNA敲除。用陰性對照siRNA（NC-siRNA）和3個HO-1-siR?NA（#1、#2、#3）轉(zhuǎn)染NP細(xì)胞。然后，對細(xì)胞進(jìn)行HO-1的Western blotting檢測（H）。3個獨立實驗的定量數(shù)據(jù)（I）。#2 HO-1-siRNA表現(xiàn)出最好的擊倒效果，并用于本研究的所有后續(xù)實驗。J、K為Western blotting。將陰性對照siRNA（NC-siRNA）和HO-1-siRNA（#2）轉(zhuǎn)染NP細(xì)胞。然后，用或不加HO-1誘導(dǎo)劑鈷原卟啉IX（10μm）預(yù)處理細(xì)胞，用12 dyne/cm2的FSS處理2 h，然后用Western blotting檢測HO-1（J）。來自3個獨立實驗的定量數(shù)據(jù)（K）。L、M為SGAG含量（L采用阿辛藍(lán)染色，×100）。NP細(xì)胞按面板（J）處理，阿利新藍(lán)染色和Blycan硫酸化糖胺多糖檢測。來自3個獨立實驗的SGAG含量的定量數(shù)據(jù)（M）。N-R為Western blotting。NP細(xì)胞與面板（J）一樣處理，然后用Western blotting檢測所示蛋白的表達(dá)。定量數(shù)據(jù)來自3個獨立的實驗（O～R）]

2.6 雷帕霉素逆轉(zhuǎn)FSS處理的NP細(xì)胞中HO-1基因敲除誘導(dǎo)的自噬和ECM穩(wěn)態(tài)改變 我們接下來確定雷帕霉素處理對FSS處理的NP細(xì)胞中HO-1敲低誘導(dǎo)的自噬抑制的影響。首先用HO-1 siRNA轉(zhuǎn)染NP細(xì)胞，然后用或不用雷帕霉素預(yù)處理NP細(xì)胞12 h，進(jìn)行FSS處理2 h，結(jié)果顯示雷帕霉素處理NP細(xì)胞可顯著提高LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，Beclin-1蛋白的表達(dá)水平和自噬體和自噬溶酶體的形成（圖4A～F）。此外，雷帕霉素處理也逆轉(zhuǎn)了FSS處理的NP細(xì)胞中HO-1敲除誘導(dǎo)的sGAG含量的降低和ECM蛋白表達(dá)的改變（圖4G～M）。

2.7 CoPP或雷帕霉素可大量逆轉(zhuǎn)FSS處理的NP細(xì)胞中IFT88缺失誘導(dǎo)的自噬和ECM穩(wěn)態(tài)的改變 最后，我們確定雷帕霉素或CoPP上調(diào)HO-1是否可以逆轉(zhuǎn)FSS處理的NP細(xì)胞中IFT88敲低誘導(dǎo)的自噬和ECM蛋白表達(dá)的改變。首先用IFT88-siRNA轉(zhuǎn)染NP細(xì)胞，然后，用CoPP（10μm）或雷帕霉素（500 nm）預(yù)處理細(xì)胞，再進(jìn)行FSS處理。結(jié)果顯示，CoPP或雷帕霉素處理均在很大程度上逆轉(zhuǎn)了IFT88敲除誘導(dǎo)的LC3-II/LC3-I比值和Beclin-1蛋白水平的改變（圖5A～C）、自噬體和自噬溶酶體的形成（圖5D～F）、sGAG含量（圖5G、H）以及合成代謝和分解代謝ECM蛋白的表達(dá)（圖5I～M）。

圖3 HO-1介導(dǎo)FSS誘導(dǎo)的NP細(xì)胞自噬[A～C為Western blotting。NP房間有或沒有12 dyne/cm2 FSS被對待2 h，然后為指示的蛋白質(zhì)表示西方的弄污。LC3-II/LC3-I比值（B）和Beclin-1（C）的定量。D為透射電子顯微鏡（TEM）。NP細(xì)胞按圖（A）處理，顯示了TEM圖像。箭頭表示不同階段的雙膜自噬體和自噬溶酶體。條形，500 nm。E為自噬體和自噬溶酶體的測量,免疫熒光染色，×400。用表達(dá)串聯(lián)mRFP-GFP-LC3構(gòu)建體的慢病毒感染NP細(xì)胞，用12 dyne/cm2 FSS處理2 h，獲得熒光圖像。條形，5μm。F為自噬體（黃點）和自噬溶酶體（游離紅點）的定量。G～I(xiàn)為Western blotting。NP細(xì)胞首先用和不用HO-1 siRNA敲低，在有和無CoPP的情況下處理。然后，用或不用HO-1誘導(dǎo)劑鈷原卟啉（CoPP）IX（10 μm）預(yù)處理細(xì)胞，并進(jìn)行12 dyne/cm2 FSS處理2 h，然后進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法以表達(dá)指定蛋白。來自3個獨立實驗（H、I）的LC3-II/LC3-I比值和Beclin-1的定量。J為TEM。NP細(xì)胞按圖G處理。顯示了TEM圖像。箭頭表示雙膜自噬體和自噬溶酶體。條形，500 nm。K、L自噬體和自噬溶酶體的測量。K采用免疫熒光染色，×400。用表達(dá)串聯(lián)mRFP-GFP-LC3結(jié)構(gòu)的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)NP細(xì)胞，并按圖G處理。獲得熒光圖像。L為來自3個獨立實驗的自噬體（黃點）和自噬溶酶體（游離紅點）的定量]

3 討 論

在本研究中，我們證明了FSS對NP細(xì)胞ECM穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的影響。我們發(fā)現(xiàn)FSS以負(fù)荷大小和時間依賴性方式調(diào)節(jié)ECM代謝。當(dāng)NP細(xì)胞受到24 dyne/cm2FSS處理時，ECM合成代謝和分解代謝之間的平衡被破壞，表現(xiàn)為sGAG含量和Col2和聚集蛋白聚糖的表達(dá)減少，ECM降解蛋白酶MMP13和ADAMTS5的表達(dá)增加。然而，當(dāng)NP細(xì)胞暴露于相對中等 的FSS（12 dyne/cm21～2 h）時，F(xiàn)SS通過促進(jìn)ECM合成代謝和抑制ECM分解代謝維持ECM穩(wěn)態(tài)。觀察到的中度FSS的促合成代謝和抗分解代謝作用與之前在暴露于不同機(jī)械刺激的各種細(xì)胞類型中的研究一致。在大鼠纖維軟骨細(xì)胞中，Tabeian等［10］報道動態(tài)拉伸應(yīng)變可顯著消除IL-1β誘導(dǎo)的MMP上調(diào)（MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP13、 MMP16、MMP17 和MMP19）。在人軟骨細(xì)胞中，He等［11］發(fā)現(xiàn)中度循環(huán)拉伸應(yīng)變可降低MMP-1和MMP-13的蛋白表達(dá)，并發(fā)揮抗分解代謝作用以保護(hù)軟骨完整性。Binch等［12］的結(jié)果證明，動態(tài)壓迫可促進(jìn)脂肪干細(xì)胞中Col2和聚集蛋白聚糖的合成。我們的結(jié)果提示，NP細(xì)胞可以啟動早期ECM合成過程，以維持ECM穩(wěn)態(tài)，以應(yīng)對中度FSS，深入了解中度FSS調(diào)節(jié)NP細(xì)胞ECM穩(wěn)態(tài)的具體機(jī)制可能有助于我們尋找IVD變性的新的和早期預(yù)防和治療靶點。

越來越多的證據(jù)表明，HO-1可以減弱炎癥和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的NP細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中ECM合成代謝和分解代謝之間的不平衡［13-15］。在這項研究中，我們進(jìn)行了RNA測序分析，并重點關(guān)注HO-1，它在暴露于中度FSS的NP細(xì)胞中顯著上調(diào)。我們發(fā)現(xiàn)，HO-1抑制降低了中度FSS暴露的NP細(xì)胞中sGAG含量，下調(diào)了ECM合成代謝相關(guān)蛋白（Col2a1，聚集蛋白聚糖）并上調(diào)了ECM分解代謝相關(guān)蛋白（MMP13，ADAMTS5），這可以被HO-1誘導(dǎo)劑CoPP逆轉(zhuǎn)。這提示HO-1在中度FSS誘導(dǎo)的ECM穩(wěn)態(tài)維持中起著關(guān)鍵性作用。

圖4 雷帕霉素調(diào)節(jié)NP細(xì)胞的自噬和ECM[A～C為Western blotting。NP細(xì)胞先用HO-1 siRNA轉(zhuǎn)染，用自噬激活劑雷帕霉素（RAP，500 nm）處理12 h，然后用12 dyne/cm2 FSS處理細(xì)胞2 h，然后用Western blotting檢測指示蛋白的表達(dá)。來自3個獨立實驗（B、C）的LC3-II/LC3-I比值和Beclin-1的定量。D為透射電子顯微鏡（TEM）。NP細(xì)胞按圖（A）處理。顯示了TEM圖像。箭頭表示雙膜自噬體和自噬溶酶體。條形，500 nm。E為自噬體和自噬溶酶體的測量。E采用免疫熒光染色（×400），表達(dá)串聯(lián)mRFP-GFP-LC3結(jié)構(gòu)的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)NP細(xì)胞，并按圖（A）處理。獲得熒光圖像。F為來自3個獨立實驗的自噬體（黃點）和自噬溶酶體（游離紅點）的定量。G、H為sGAG含量。G采用阿辛藍(lán)染色，×100。H為Blyscan硫酸糖胺聚糖測定。I～M為Western blotting。NP細(xì)胞按圖（A）處理，然后用免疫印跡法檢測指定蛋白的表達(dá)（I）。來自3個獨立實驗（J～M）的Col2a1、聚集蛋白聚糖、MMP13和ADAMTS5的定量]

不同研究組的結(jié)果表明，F(xiàn)SS可誘導(dǎo)骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和肝細(xì)胞癌細(xì)胞發(fā)生保護(hù)性自噬［16-18］。與以前的研究一致，我們的數(shù)據(jù)證明適度的FSS通過增加LC3-II與LC3-I的比率，Beclin-1的蛋白表達(dá)和自噬體和自噬溶酶體的數(shù)量來激活NP細(xì)胞的自噬。HO-1上調(diào)作為自噬誘導(dǎo)的一種手段在許多疾病中都有報道［19-20］。例如，在鎘誘導(dǎo)的肺氣腫小鼠模型中，Surolia等［21］發(fā)現(xiàn)HO-1介導(dǎo)自噬的激活，并保護(hù)肺內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和肺氣腫的發(fā)生。而在糖尿病腎病細(xì)胞模型中，Dong等［22］報道HO-1可以增強(qiáng)自噬，抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡。在這項研究中，我們證明HO-1抑制了FSS誘導(dǎo)的自噬激活，而HO-1誘導(dǎo)劑CoPP逆轉(zhuǎn)了這一過程。此外，自噬激活劑雷帕霉素減弱HO-1抑制誘導(dǎo)的FSS誘導(dǎo)的NP細(xì)胞自噬激活和ECM穩(wěn)態(tài)的破壞。總的來說，這些結(jié)果表明適度的FSS維持NP細(xì)胞的ECM穩(wěn)態(tài)，至少部分是通過HO-1介導(dǎo)的自噬。

盡管以上結(jié)果表明FSS可以通過HO-1介導(dǎo)的NP細(xì)胞自噬來調(diào)節(jié)ECM的動態(tài)平衡，但細(xì)胞如何感知FSS并將其轉(zhuǎn)化為下游分子信號仍不清楚。初級纖毛是一種以微管為基礎(chǔ)的細(xì)胞器，它作為單個突起從大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞類型的表面延伸出來，包括NP細(xì)胞。它可以感知和傳遞細(xì)胞外的機(jī)械和化學(xué)信號，以調(diào)節(jié)各種細(xì)胞過程，并維持組織的動態(tài)平衡［23］。由于初級纖毛不能合成蛋白質(zhì)，纖毛相關(guān)運輸?shù)鞍?，如IFT88，因此對纖毛的生物發(fā)生、維持和功能至關(guān)重要。最近的研究表明，IFT88的亞型突變可以導(dǎo)致初級纖毛嚴(yán)重發(fā)育不良，并取消周期性拉伸應(yīng)變對軟骨細(xì)胞對IL-1β炎癥反應(yīng)的抑制作用［24］。此外，Miceli等［25］報道了IFT88的亞型缺失損害了纖毛組裝，并抑制了FSS誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞自噬激活。因此，我們推測當(dāng)NP細(xì)胞暴露于FSS時，與IFT88相關(guān)的初級纖毛可能在機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。正如預(yù)期的那樣，轉(zhuǎn)染IFT88-siRNA的NP細(xì)胞顯示出初級纖毛的缺陷，初級纖毛的破壞下調(diào)了HO-1的蛋白表達(dá)，抑制了自噬激活，破壞了適度FSS暴露的NP細(xì)胞的ECM動態(tài)平衡。同時，我們發(fā)現(xiàn)COPP和RAP都部分逆轉(zhuǎn)了這種變化。因此，我們的數(shù)據(jù)表明，初級纖毛可以感知和介導(dǎo)適度的FSS信號，以調(diào)節(jié)HO-1介導(dǎo)的自噬激活，從而維持NP細(xì)胞的ECM動態(tài)平衡。

圖5 HO-1上調(diào)或雷帕霉素逆轉(zhuǎn)FSS處理的NP細(xì)胞中IFT88缺失誘導(dǎo)的自噬和ECM產(chǎn)生的改變[A～C為Western blotting。用IFT88-siRNA轉(zhuǎn)染NP細(xì)胞。然后，用CoPP（10μm）或雷帕霉素（RAP，500 nm）預(yù)處理細(xì)胞，用12 dyne/cm2 FSS處理2 h，然后用免疫印跡法檢測LC3-I、LC3-II和Beclin-1（A）的表達(dá)。來自3個獨立實驗（B、C）的LC3-I/LC3-II比值和Beclin-1的定量。D為透射電子顯微鏡（TEM）。NP細(xì)胞按圖A處理。顯示了TEM圖像。箭頭表示雙膜自噬體和自噬溶酶體。條形，500 nm。E為自噬體和自噬溶酶體的測量。免疫熒光染色，×400。用表達(dá)串聯(lián)mRFP-GFP-LC3結(jié)構(gòu)的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)NP細(xì)胞，并按圖A處理。獲得熒光圖像。F為來自3個獨立實驗的自噬體（黃點）和自噬溶酶體（游離紅點）的定量。G采用阿辛藍(lán)染色，×100。H為Blyscan硫酸糖胺聚糖測定。I～M為Western blotting。NP細(xì)胞按圖A處理，然后用免疫印跡法檢測指定蛋白的表達(dá)（I）。來自3個獨立實驗（J～M）的Col2a1、聚集蛋白聚糖、MMP13和ADAMTS5表達(dá)的定量]

綜上所述，中度FSS可以維持NP細(xì)胞的ECM穩(wěn)態(tài)，這需要在初級纖毛存在的情況下通過HO-1介導(dǎo)的自噬激活。這項研究可以使我們更好地理解中度FSS介導(dǎo)的NP細(xì)胞ECM穩(wěn)態(tài)的維持，并可能為開發(fā)早期預(yù)防和治療IVD變性的新策略帶來曙光。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。