崔羅敏，萬 麟，周樹軍

(江西農(nóng)業(yè)大學 林學院，南昌 330045)

百合為百合科百合屬(Lilium)植物的統(tǒng)稱，是世界范圍內(nèi)最重要的鮮切花之一?，F(xiàn)代百合主要有亞洲百合(Asiatic, A)、東方百合(Oriental, O)、鐵炮百合(Longiflorum, L)和喇叭百合(Trumpet, T)等組內(nèi)雜交品種群；而不同種系具有不同的優(yōu)點，組間雜交品種結合了兩個組的優(yōu)點，雜種優(yōu)勢突出，如：LA、OT、LO、OA等[1-3]。

LO百合是由鐵炮百合與東方百合通過組間遠緣雜交獲得的雜交品種，一般為三倍體(2n = 3x = 36)[2]。盡管三倍體百合一般雄性不育，但作為母本可與合適的父本進行雜交獲得一些非整倍體后代[4-11]。因此，利用三倍體來獲得非整倍體是非常有效的方法，可以為百合新品種篩選創(chuàng)造更多機會。龍牙百合(L.browniivar.viridulumBaker, BB)是野百合(L.brownii)的變種，為三大食用百合之一，是江西萬載地區(qū)特色經(jīng)濟植物，具有鱗片豐滿肥厚，產(chǎn)量較高，品質(zhì)較佳，營養(yǎng)豐富等優(yōu)良食用品質(zhì)，具有一定藥用價值，同時也有一定的觀賞價值[12-13]。目前關于龍牙百合的研究主要在食用、栽培、脫毒等方面[14-15]，而關于育種方面的研究相對較少[16-17]，特別是關于龍牙百合與觀賞百合的雜交育種研究鮮有報道。LO百合具有植株高、花型大、香味甘甜、易繁殖等優(yōu)點，利用LO觀賞百合與龍牙百合雜交實現(xiàn)種質(zhì)創(chuàng)新具有一定的生產(chǎn)意義。

本研究選擇異源三倍體百合Triumphator(LLO)為母本，龍牙百合為父本，采用常規(guī)授粉和切柱頭授粉的方式進行雜交，對母本及胚搶救后所得子代進行基因組熒光原位雜交(GISH)鑒定，分析母本和后代的染色體數(shù)目和組成，為培育可食可賞的百合品種提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試材料有異源三倍體百合Triumphator(LLO)與龍牙百合(BB)。其中 Triumphator 為荷蘭引進的品種，購自浙江虹越花卉有限公司；龍牙百合購于江西宜春市萬載縣百合種植戶。2種百合均栽種于江西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)生態(tài)科技園大棚內(nèi)并進行常規(guī)管理。

1.2 方 法

1.2.1 雜交授粉待龍牙百合剛開花時，采集其花藥盛于變色硅膠干燥器中，室溫保存； Triumphator于花朵開放前去雄，于2019年5月30日至6月2日采用常規(guī)授粉與切柱頭授粉。常規(guī)授粉：將父本花粉均勻涂抹在母本柱頭上；切柱頭授粉：在距其子房約2～10 mm處，用刀片迅速切去柱頭，保持切口朝上，取父本花粉蘸到柱頭切口上。授粉之后立即用錫箔紙輕輕包裹柱頭。常規(guī)授粉與切柱頭授粉分別為13和32朵花。

1.2.2 胚搶救授粉6～8周后，果實開始變黃或變軟時剪取至實驗室進行胚培養(yǎng)[18]。培養(yǎng)基組成為2.2 g·L-1MS (Duchefa Biochemie，荷蘭) + 60 g·L-1蔗糖 + 4 g·L-1瓊脂 (Duchefa Biochemie，荷蘭)(pH 5.8)。果實在超凈工作臺上用75%的酒精消毒后，將胚或胚乳發(fā)育不明顯的胚珠直接放入培養(yǎng)基中，有胚乳或胚發(fā)育的胚珠剝除種皮后再放入培養(yǎng)基中，后放置25 ℃中進行暗培養(yǎng)。萌發(fā)后轉入培養(yǎng)基[2.2 g·L-1MS + 50 g·L-1蔗糖 + 4 g·L-1瓊脂(pH 5.8)]，在25 ℃下2 000 Lx的光照培養(yǎng)室進行培養(yǎng)。

1.2.3 染色體制片有絲分裂染色體制備參照Zhou等[19]的方法。取長度大約1 cm左右的百合根尖，用0.7 mmol·L-1放線菌酮(Duchefa Biochemie，荷蘭)在25 ℃下處理4 h，置于卡諾固定液(無水乙醇∶冰乙酸=3∶1，V/V)中4 ℃固定12 h以上備用。取出固定的根尖加入1%的果膠酶和纖維素酶(蘭博利德，北京)混合液，在37 ℃下處理50 min左右，使其充分酶解軟化。取出酶解的根置于載玻片上加1滴45%乙酸混勻，蓋上蓋玻片，鏡檢觀察較好的中期分裂相用于GISH分析。

1.2.4 基因組原位雜交(GISH) GISH流程參照Xiao等[20]的方法。東方百合Sorbonne與鐵炮百合White fox的基因組DNA作探針，其中東方百合基因組DNA用Biotin-11-dUTP標記(Roche，德國)，鐵炮百合基因組DNA用Digoxigenin-16-dUTP標記(Roche，德國)。采用常規(guī)染色體制片，雜交混合液體積為40 μL/片，其中含有25～50 ng探針DNA，50%去離子甲酰胺(索萊寶，北京)，10%硫酸葡聚糖(索萊寶，北京)，2 × SSC(Duchefa Biochemie，荷蘭)和1～3 μg封阻DNA(索萊寶，北京)。分別用Cy-3和FITC檢測系統(tǒng)檢測，用Vectashield-1200(含DAPI)(Roche，德國)封片。最后在蔡司熒光顯微鏡(ZEISS Scope. A1，德國)下觀察并照相，每個材料選擇3～5個較好的中期分裂相分析。

2 結果與分析

Triumphator與龍牙百合采用常規(guī)授粉與切柱頭授粉雜交均獲得發(fā)育較好的果實，結實率分別為23.08%與43.75%，平均有胚數(shù)分別為0.54、0.22(圖1，表1)。表明三倍體LLO百合與龍牙百合具有較好的親和性，常規(guī)授粉獲得26株幼苗，切柱頭授粉獲得14株幼苗(圖1，表1)。這說明LO百合Triumphator與龍牙百合雜交采用常規(guī)授粉具有更好的親和性。

表1 Triumphator 與龍牙百合雜交結果統(tǒng)計

A. 雜交果實：1. 常規(guī)授粉；2. 切柱頭授粉；B1. 常規(guī)授粉獲得的幼苗；B2. 切柱頭授粉獲得的幼苗圖1 雜交果實和胚搶救獲得幼苗(標尺 = 1 cm)A. Hybrid fruit: 1. Normal pollination; 2. Cut style pollination; B1. The progenies from normal pollination; B2. The progenies from cut pollinationFig.1 Hybrid fruit and the seedlings from embryo rescue (Bar = 1 cm)

從不同授粉方式獲得的雜交后代中各取4株發(fā)育較好的幼苗和母本進行 GISH分析(圖2)。通過GISH分析來自Longiflorum (L)和Oriental (O)基因組的染色體可清楚區(qū)分，但L基因組與B基因組的染色體卻難以區(qū)分，這可能由于鐵炮百合與龍牙百合親緣關系較近。親本Triumphator為LLO異源三倍體(2n = 3x = 36)，而所有鑒定的雜交后代均為非整倍體，子代的染色體變化范圍為26～32，平均為29.75條(表2)，且親本與子代均無重組現(xiàn)象，其中L與B基因組染色體總共為24條。由于作父本的龍牙百合產(chǎn)生的花粉含有12條染色體(n = x = 12)，因此可推斷出三倍體母本產(chǎn)生的卵細胞的染色體數(shù)目變化范圍為14～20，即來自母本卵細胞的染色體組成為12條L基因組和2～8條O基因組染色體。

表2 8個雜交子代基因組成

A. Triumphator;B-E. 常規(guī)授粉后代;F-I.切柱頭授粉后代;B2與F2藍色標記為東方百合染色體；其他圖中藍色標記和綠色標記為鐵炮百合與龍牙百合，粉色標記為東方百合染色體；表2幼苗編號同此圖。標尺 = 10 μm圖2 母本及雜交子代GISH結果A. Triumphator; B-E. Normal pollination progenies; F-I. Cut style pollination progenies; Oriental chromosomes are blue of B2 and F2; Longiflorum and L. brownii var. viridulum chromosomes are blue and green, Oriental chromosomes are pink； Table 2 seedling code are the same as this figure. Bar = 10 μmFig.2 The results of GISH of parents and progenies

3 討 論

3.1 關于百合授粉技術

切割柱頭在百合育種中較為常用，在一定程度上能夠有效地克服遠緣雜交中受精前障礙[17, 21]。本研究采用常規(guī)授粉和切柱頭授粉均獲得了發(fā)育較好的果實和一定的幼苗，但采用常規(guī)授粉獲得幼苗的比例明顯比采用切柱頭授粉的高。有研究發(fā)現(xiàn)切割柱頭授粉有時會降低雜交結實率，這可能是切柱頭授粉后由于缺少了柱頭的緩沖能力和柱頭分泌液的刺激作用，降低了花粉的萌發(fā)[22]；或者可能是花粉管沒有得到花柱中營養(yǎng)或信號的供給[23]。通常在親緣性較近時采用常規(guī)授粉比切柱頭授粉的得胚率明顯更高[24]，這可能是龍牙百合與LLO三倍體中的鐵炮百合基因組親緣關系較近，采用切柱頭授粉可能降低了花粉的萌發(fā)或者減少了花粉管進入花柱時的營養(yǎng)吸收和信號。

3.2 龍牙百合歸屬情況

De Jong[25]將野百合(L.brownii)劃分于Archelirion組，后人研究發(fā)現(xiàn)野百合與Archelirion組中其他的百合親緣關系并不緊密，因而將其劃入Leocolirion組更合適[26]，而龍牙百合為野百合的變種。本試驗結果得出鐵炮百合的基因組與龍牙百合的基因組通過GISH分析難以區(qū)分，說明龍牙百合與鐵炮百合親緣性更近。

3.3 關于Triumphator(LLO)與龍牙百合雜交

三倍體植株一般高度不育，但這只是相對的，如百合三倍體雖然多為雄性不育，但卻可以作為母本與合適的二倍體或四倍體雜交，產(chǎn)生的后代多為非整倍體，如AAA × AA/AAAA, LAA × AA/AAAA, OTO × OO/TT[4, 11, 27-29]。這主要是百合為貝母型植物，三倍體百合雖然減數(shù)分裂異常，但最終形成的極核基因組始終為體細胞的2倍，從而與整倍體父本雜交后形成了整倍體胚乳，整倍體的胚乳可以供養(yǎng)非整倍體胚的發(fā)育[4, 6-11]。

基因組熒光原位雜交(GISH)可以區(qū)分不同來源的染色體組，本試驗結果發(fā)現(xiàn)鐵炮百合的基因組與龍牙百合的基因組通過GISH分析難以區(qū)分，這也證實了龍牙百合與鐵炮百合兩個基因組親緣性較近。本試驗獲得的雜交后代均為非整倍體，通過GISH分析表明，這些非整倍體雜交后代L與B基因組染色體總共為24條，且無重組現(xiàn)象，這與前人在LLO × TTTT、LLO × OTOT中的報道是一致的[30-31]。這是由于三倍體減數(shù)分裂異常，可能是LLO百合基因組中的24條L基因組染色體基本正常的聯(lián)會配對，而O基因組染色體基本未正常聯(lián)會配對，在后期時O基因組染色體隨機分配到子細胞中。通過三倍體獲得的非整倍體后代在形態(tài)性狀方面可能表現(xiàn)出很大的差異。因此，利用三倍體來獲得非整倍體是非常有效的方法，可以為選育百合新品種創(chuàng)造更多的機會。研究異源三倍體LO百合與龍牙百合的雜交親和性，實現(xiàn)賞食兼?zhèn)涞陌俸戏N質(zhì)創(chuàng)新具有較高理論和實踐意義。