呂艷芳，梁倩倩，郭雨晴，李學(xué)鵬，劉欣欣，沈 琳，勵(lì)建榮,

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121013；2.上海交通大學(xué)分析測(cè)試中心，上海 200240；3.大連東霖食品股份有限公司，遼寧 大連 116007）

多酚是指存在于植物體內(nèi)、化學(xué)結(jié)構(gòu)中包含多個(gè)酚羥基的一類化合物的總稱。多酚類物質(zhì)是重要的功能性成分，具有抗氧化、抗菌和抗癌等多種功能，而這些功能可能是由于多酚與體內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等靶分子直接或間接相互作用所致[1]。目前，關(guān)于多酚的研究報(bào)道有很多，Chen Xiaowei等[2]研究了蘆丁對(duì)大豆蛋白界面性能和乳液穩(wěn)定性的影響。黃淵等[3]分別研究了白藜蘆醇、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）和沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）對(duì)鰱魚肌球蛋白（silver carp myosin，SCM）空間結(jié)構(gòu)的影響。

原兒茶醛（protocatechuic aldehyde，PCA）的結(jié)構(gòu)如圖1A所示，化學(xué)名稱為3,4-二羥基苯甲醛，多見于烏蕨、四季青和丹參的根葉部，具有多種生理活性。近年來，對(duì)于PCA的研究主要集中在醫(yī)藥領(lǐng)域。祝友文等[4]和高麗[5]分別研究發(fā)現(xiàn)PCA對(duì)環(huán)磷酰胺引起雄性小鼠的生殖損傷和順鉑介導(dǎo)的小鼠急性腎臟損傷具有保護(hù)作用。張寒等[6]發(fā)現(xiàn)PCA具有舒張血管的功能。另外，PCA也是合成其他香料和藥物的中間體[7]。PCA由于具有鄰二酚母核結(jié)構(gòu)而展現(xiàn)出顯著的抗氧化活性，Bountagkidou等[8]通過研究添加5 種天然多酚防腐劑的木桶裝紅酒的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)只有PCA在所有測(cè)定環(huán)境中均對(duì)紅酒表現(xiàn)出高抗氧化活性，因此有望將其用作食品抗氧化劑，但目前PCA在食品領(lǐng)域的研究及應(yīng)用都比較少，這可能與其作用機(jī)制不明有一定關(guān)系。

圖1 PCA（A）、FA（B）結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of PCA (A) and FA (B)

阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A）的結(jié)構(gòu)如圖1B所示，化學(xué)名稱為4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，主要存在于麥麩等谷物和川芎等中草藥中。FA的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性良好，且毒性較低，又因其具有良好的藥理作用和生物活性，越來越多的國家開始將其用于食品、醫(yī)藥等各個(gè)領(lǐng)域。李黎云[9]發(fā)現(xiàn)在待宰育肥豬的日糧中添加FA，會(huì)增加豬肉產(chǎn)品的嫩度，且延長保質(zhì)期。魏延玲等[10]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A能夠抑制風(fēng)干鱸魚中N-二甲基亞硝胺的生成以及微生物的生長繁殖，并能有效清除鱸魚中殘留的亞硝酸鹽，從而降低人類患高血壓、癌癥等疾病的機(jī)率。饒文婷等[11]發(fā)現(xiàn)FA能夠調(diào)節(jié)腸道菌群。近年來，F(xiàn)A的多功能性使其成為食品添加劑領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[12]，因此對(duì)其作為食品添加劑的安全性進(jìn)行評(píng)估至關(guān)重要，通過研究FA與生物大分子的相互作用，從而深入理解FA結(jié)構(gòu)變化對(duì)其毒理性質(zhì)和功能特性的影響，對(duì)新型天然食品添加劑的開發(fā)有重要的意義。

人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是血液中的多功能轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能可逆結(jié)合小分子物質(zhì)并將其運(yùn)送到人體需要的各個(gè)部位。牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）在序列和構(gòu)象上與HSA具有高度同源性和相似性，且價(jià)格相對(duì)比較便宜，因此被廣泛應(yīng)用于小分子物質(zhì)與血清蛋白的研究中[13]。隨著計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)的迅速發(fā)展以及更多蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的解析，分子對(duì)接已經(jīng)成為研究小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的重要手段。Cheng Hao等[14]應(yīng)用光譜法結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)對(duì)比研究了順式、反式白藜蘆醇與BSA的相互作用。Das等[15]應(yīng)用該技術(shù)研究了EGCG與牛血紅蛋白（hemoglobin，HGB）的相互作用。

利用分子對(duì)接技術(shù)研究蛋白質(zhì)與多酚間的相互作用，并同光譜實(shí)驗(yàn)的結(jié)論進(jìn)行分析、比較從而互相驗(yàn)證、補(bǔ)充，進(jìn)而能夠從實(shí)驗(yàn)和理論研究其相互作用。目前，關(guān)于PCA和FA與大分子相互作用的機(jī)理研究較少，并且在食品領(lǐng)域的應(yīng)用范圍也較小，為使其在食品加工、貯藏保鮮等多個(gè)領(lǐng)域中像EGCG、茶多酚和白藜蘆醇等多酚一樣被廣泛應(yīng)用，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用紫外光譜、熒光光譜、同步熒光光譜以及分子模擬技術(shù)綜合分析PCA和FA與BSA相互作用的機(jī)制，有助于在分子水平上了解其與蛋白質(zhì)的相互作用，最終為PCA和FA在食品領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PCA、FA（純度≥99%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；BSA（純度≥98%） 美國Sigma公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉（均為分析純） 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MS105DU電子分析天平、FiveEasy Plus FE28 pH計(jì)瑞士梅特勒-托利多公司；KX-1990超聲波清洗儀 北京科璽有限公司；DK8D電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；UV2550紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；FluoroMax-4熒光光度計(jì) 法國HORIBA公司。

1.3 方法

1.3.1 紫外光譜法測(cè)定PCA和FA與BSA的相互作用

于7 支試管中分別移取質(zhì)量濃度2.5×10－3g/mL的BSA溶液0.5 mL和濃度為1.0×10－4mol/L的PCA、FA溶液分別0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL，最后用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）（0.067 mol/L，pH 7.4）稀釋，使多酚的終濃度分別為0、5×10－6、10×10－6、15×10－6、20×10－6、25×10－6、30×10－6mol/L，BSA終質(zhì)量濃度為2.5×10－4g/mL，充分混勻后，于298 K靜置10 min，使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描200～800 nm的范圍，以濃度為0 mol/L的PCA、FA溶液作為對(duì)照。

1.3.2 熒光光譜法測(cè)定PCA和FA與BSA的相互作用

取3 組試管，每組8 支，分別加入質(zhì)量濃度為2.5×10－3g/mL的BSA溶液0.5 mL和1.0×10－4mol/L的PCA、FA溶液分別為0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75 mL，以PBS（0.067 mol/L，pH 7.4）定容，使多酚終濃度分別為0、5×10－6、10×10－6、15×10－6、20×10－6、25×10－6、30×10－6、35×10－6mol/L，BSA終質(zhì)量濃度為2.5×10－4g/mL，充分混勻后，將第1組混合溶液于298 K靜置10 min，第2組于310 K恒溫水浴10 min，第3組于320 K恒溫水浴10 min，使用熒光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描，在激發(fā)波長281 nm、狹縫寬度5 nm、掃描范圍280～450 nm的條件下檢測(cè)，并以PCA、FA濃度均為0 mol/L的溶液作為對(duì)照。

1.3.3 熒光猝滅計(jì)算

通過Stern-Volmer方程（1）計(jì)算猝滅常數(shù)的變化，以判斷PCA和FA對(duì)BSA的熒光猝滅類型；采用雙對(duì)數(shù)方程（2）計(jì)算PCA和FA分別與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n；使用熱力學(xué)方程（3）和（4）計(jì)算PCA和FA分別與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)[16]。

式中：F0為對(duì)照組的熒光強(qiáng)度；F為PCA和FA濃度為Q時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度；[Q]為PCA和FA的濃度/（mol/L）；Ksv為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)/（L/mol），可由F0/F對(duì)[Q]的斜率求得；Kq為猝滅速率常數(shù)/（L/（mol·s））；τ0為猝滅劑不存在時(shí)生物大分子的平均熒光壽命（約為10－8s）；ΔG為自由能變/（kJ/mol）；ΔH為焓變/（kJ/mol）；ΔS為熵變/（J/（mol·K））。

1.3.4 同步熒光光譜法測(cè)定PCA和FA與BSA的相互作用

BSA和多酚溶液處理方法同1.3.1節(jié)所敘述的方式。以波長差（Δλ）分別為15 nm和60 nm、狹縫寬度：1 nm、掃描范圍：200～400 nm的條件進(jìn)行同步熒光檢測(cè)。

1.3.5 分子對(duì)接

從PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/pdb）搜索ID編號(hào)：“4F5S”的BSA晶體結(jié)構(gòu)并下載[17]，利用PyMol軟件對(duì)BSA進(jìn)行去亞基、去水和刪除小分子配體等操作，并保存成PDB格式；從PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取PCA（CID：8768）和FA（CID：445858）的二維結(jié)構(gòu)[18]，運(yùn)用ChemDraw軟件對(duì)其進(jìn)行能量優(yōu)化并保存成PDB格式，然后利用AutoDock軟件對(duì)BSA、PCA和FA進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷等前處理步驟后，保存成PDBQT格式，最后使用AutoDock-vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接結(jié)果采用Discovery Studio 2017 R2 Client、PyMol軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCA和FA與BSA相互作用的紫外光譜分析

298 K時(shí)不同濃度的PCA和FA分別與BSA相互作用的紫外光譜結(jié)果如圖2所示，當(dāng)PCA和FA為0 mol/L時(shí)，BSA在276 nm波長處有一強(qiáng)吸收峰，這主要是由BSA的酪氨酸（tyrosine，Tyr）、色氨酸（tryptophan，Trp）殘基的苯環(huán)π→π*躍遷產(chǎn)生[19]。PCA和FA濃度在0～30×10－6mol/L的范圍時(shí)，隨著PCA和FA濃度的增加，BSA在276 nm波長處的吸收峰強(qiáng)度不斷增大，且波長從276 nm紅移至280 nm，說明PCA和FA的加入使BSA分子內(nèi)部的Trp、Tyr殘基裸露于水相中，疏水殘基間的疏水作用力減弱，從而與BSA形成復(fù)合物，導(dǎo)致BSA的共軛程度增強(qiáng)，產(chǎn)生了新的π→π*躍遷，最終引起B(yǎng)SA紫外吸收強(qiáng)度增大，吸收峰紅移[20]。動(dòng)態(tài)猝滅不引起蛋白質(zhì)吸收峰波長改變，而靜態(tài)猝滅則會(huì)導(dǎo)致吸收峰波長改變[21]。因此，初步判斷PCA和FA對(duì)BSA的猝滅過程均為靜態(tài)猝滅。

圖2 298 K時(shí)PCA（A）、FA（B）與BSA相互作用的紫外吸收光譜Fig.2 UV absorption spectra of PCA-BSA (A) and FA-BSA (B)interactions at 298 K

2.2 PCA和FA與BSA相互作用的熒光光譜分析

298、310、320 K時(shí)，不同濃度的PCA與BSA相互作用的內(nèi)源熒光光譜如圖3所示，當(dāng)激發(fā)波長為281.0 nm時(shí)，BSA分別在347.0、349.0、345.0 nm波長處有1 個(gè)強(qiáng)熒光發(fā)射峰。Aprodu等[22]發(fā)現(xiàn)，Trp的最大熒光發(fā)射波長（λem）在308.0～352.0 nm范圍內(nèi)，而Tyr的最大熒光發(fā)射波長為304.0 nm，因此可以推斷BSA的內(nèi)源熒光主要來源于Trp殘基。由圖3、4可知，PCA和FA濃度在0～35×10－6mol/L時(shí)，隨著PCA和FA濃度的增加，3 種溫度下的BSA內(nèi)源熒光強(qiáng)度都呈下降趨勢(shì)，說明PCA和FA都可以與BSA結(jié)合，使其內(nèi)源熒光發(fā)生猝滅。BSA的內(nèi)源熒光猝滅程度隨著FA、PCA各自濃度增加而加劇，且PCA對(duì)BSA的猝滅效果比FA更明顯，其可能是因?yàn)镻CA和FA結(jié)合在BSA的Trp134殘基或Trp213殘基附近。沈亮亮[23]利用熒光光譜法研究苦丁茶中紫莖女貞苷A和紫莖女貞苷B與BSA的相互作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，紫莖女貞苷A對(duì)BSA內(nèi)源熒光的猝滅效果比紫莖女貞苷B更明顯，說明紫莖女貞苷A更接近BSA的Trp殘基。由此可以推測(cè)，PCA和FA分別與BSA作用時(shí)，PCA距離BSA的Trp134或Trp213殘基更近一些。如圖3所示，隨著PCA濃度的增大，BSA的最大熒光發(fā)射波長發(fā)生明顯紅移，其在298 K時(shí)從347.0 nm紅移到366.5 nm；其在310 K時(shí)從349.0 nm紅移到366.5 nm；其在320 K時(shí)從345.0 nm紅移到367.0 nm。由圖4可知，隨著FA濃度的增大，BSA的最大熒光發(fā)射波長也發(fā)生明顯紅移，其在298 K時(shí)從347.0 nm紅移到351.0 nm；其在310 K時(shí)從349.0 nm紅移到350.0 nm；其在320 K時(shí)從345.0 nm紅移到349.0 nm，此結(jié)果說明PCA和FA的加入均會(huì)使BSA的Trp134或Trp213殘基周圍的極性增強(qiáng)，疏水性減弱，表明Trp134殘基或Trp213殘基逐漸從BSA內(nèi)部的疏水環(huán)境中暴露出來、肽鏈逐漸伸展、發(fā)生去折疊現(xiàn)象[24]，也說明PCA、FA對(duì)BSA的猝滅均可能是靜態(tài)猝滅。另外，比較BSA分別與PCA和FA結(jié)合后最大熒光發(fā)射波長的變化，可以發(fā)現(xiàn)BSA與PCA相互作用后的最大熒光發(fā)射波長紅移更明顯，這可能與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，PCA的分子質(zhì)量低于FA的分子質(zhì)量，且PCA比FA多1 個(gè)酚羥基，所以極性更大的PCA可更大程度地增強(qiáng)Trp134殘基或Trp213殘基周圍的極性，使BSA的肽鏈更加伸展，從而更深入地插到BSA的疏水區(qū)域中[23]。

圖3 不同溫度下PCA與BSA相互作用的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of PCA-BSA interactions at different temperatures

圖4 不同溫度下FA與BSA相互作用的熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of FA-BSA interactions at different temperatures

2.3 熒光猝滅機(jī)理

2.3.1 PCA和FA對(duì)BSA的熒光猝滅類型

298、310、320 K時(shí)，PCA和FA與BSA相互作用的Stern-Volmer擬合結(jié)果如圖5所示，F(xiàn)0/F和[Q]之間存在良好的線性關(guān)系。PCA和FA與BSA相互作用的Ksv、Kq值如表1所示，隨著溫度從298 K升高到320 K，PCA與BSA相互作用的Ksv值從1.015×105L/mol減小到6.939×104L/mol，F(xiàn)A與BSA相互作用的Ksv值從4.863×104L/mol減小到3.430×104L/mol，而且在不同的溫度條件下，PCA和FA與BSA相互作用的Kq值均遠(yuǎn)大于最大動(dòng)態(tài)猝滅速率2.0×1010L/（mol·s）[25]，說明PCA和FA都分別與BSA形成了大分子復(fù)合物，且其均為靜態(tài)猝滅過程[17]。此外，在同一溫度下，PCA與BSA相互作用的Kq值均大于FA與BSA相互作用的Kq值，因此與FA相比，PCA對(duì)BSA的內(nèi)源熒光猝滅程度更大。

圖5 不同溫度下PCA（A）和FA（B）與BSA相互作用的Stern-Volmer擬合圖Fig.5 Stern-Volmer plot of PCA-BSA (A) and FA-BSA (B)interactions at different temperatures

表1 不同溫度下PCA和FA與BSA相互作用的猝滅常數(shù)Table 1Quenching constants for PCA-BSA and FA-BSA interactions at different temperatures

2.3.2 PCA和FA與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

298、310、320 K時(shí)，PCA和FA與BSA相互作用的雙對(duì)數(shù)結(jié)果如圖6所示，PCA和FA與BSA相互作用的Ka、n值如表2所示，隨著溫度從298 K升高到320 K，PCA與BSA相互作用的Ka值從1.011×106L/mol減小到1.818×105L/mol，F(xiàn)A與BSA相互作用的Ka值從8.322×105L/mol減小到4.881×104L/mol，均達(dá)到104數(shù)量級(jí)，說明PCA和FA與BSA相互作用的熒光猝滅類型均以靜態(tài)猝滅為主、動(dòng)態(tài)猝滅可忽略不計(jì)，進(jìn)一步說明PCA和FA均能與BSA形成穩(wěn)定的復(fù)合物[26]，其與2.1、2.2、2.3.1節(jié)所得結(jié)論一致。不同溫度條件下，PCA和FA與BSA相互作用的n值均接近1.000，說明PCA和FA與BSA的結(jié)合比例約為1∶1。此外，溫度相同時(shí)，PCA與BSA相互作用的Ka值均大于FA與BSA的Ka值，說明PCA與BSA之間的結(jié)合力大于FA與BSA的結(jié)合力，這可能是因?yàn)镻CA的極性強(qiáng)于FA的極性。楊淑玲等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在36～37 ℃時(shí)黃體酮（progesterone，PROG）與BSA相互作用的Ka值為1.423×104L/mol，推測(cè)PROG進(jìn)入人體后能與HSA較好地互作，從而被HSA運(yùn)輸?shù)桨衅鞴佟?10 K時(shí)PCA、FA與BSA相互作用的Ka值分別為9.005×105、2.553×105L/mol，遠(yuǎn)大于104L/mol，因此也可推測(cè)，PCA和FA均能與HSA在人體環(huán)境中進(jìn)行較好地相互作用，且PCA比FA更容易被HSA貯存、運(yùn)輸。

圖6 不同溫度下PCA（A）和FA（B）與BSA相互作用的雙對(duì)數(shù)圖Fig.6 Double logarithmic plots for PCA-BSA (A) and FA-BSA (B)interactions at different temperatures

表2 不同溫度下PCA和FA與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)Table 2Binding constants and binding site numbers for PCA-BSA and FA-BSA interactions at different temperatures

2.3.3 PCA和FA與BSA相互作用的作用力類型

PCA和FA與BSA相互作用的ΔG、ΔH、ΔS值如表3所示，在298、310、320 K共3 種不同溫度條件下，PCA和FA與BSA相互作用過程中的ΔG均小于0，說明PCA和FA與BSA的結(jié)合過程是自發(fā)進(jìn)行的。PCA與BSA相互作用的ΔS、ΔH值分別為－107.186 J/（mol·K）、－67.088 kJ/mol，F(xiàn)A與BSA相互作用的ΔS、ΔH值分別為－284.251 J/（mol·K）、－23.332 kJ/mol，其均小于0，說明PCA和FA與BSA相互作用過程中的主要作用力均為氫鍵和范德華力[28]。這與吳雨杭[29]研究染料木素、金雀花堿與BSA分別相互作用過程和黃朝波等[18]研究紅斑紅曲胺與BSA相互作用過程的作用力一致。

表3 PCA和FA與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Table 3Thermodynamic parameters for PCA-BSA and FA-BSA interactions

2.4 PCA、FA與BSA相互作用的同步熒光光譜分析

同步熒光常用來分析小分子物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響，Δλ1=15 nm和Δλ2=60 nm時(shí)，同步熒光光譜分別顯示蛋白質(zhì)中Tyr、Trp殘基的特征信息[30]。由圖7A、8A可知，隨著PCA和FA的加入，Tyr殘基的熒光發(fā)生略微藍(lán)移，說明PCA和FA會(huì)使Tyr殘基周圍的極性降低，疏水性增強(qiáng)[3]；由圖7B、8B可知，隨著PCA的加入，Trp殘基的熒光基本未發(fā)生移動(dòng)；而FA的加入，使Trp殘基的熒光發(fā)生略微紅移，說明FA使Trp殘基周圍的極性增加，疏水性減弱。由圖7、8可知，BSA中的Tyr、Trp殘基分別在303、346 nm處有最大特征吸收峰，Trp的熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)大于Tyr，其對(duì)應(yīng)關(guān)系約為10∶1，這主要是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)中熒光強(qiáng)度比約為Trp∶Tyr∶Phe=100∶9∶0.5[18]。隨著PCA和FA濃度的增加，Tyr和Trp的熒光均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，且Trp的熒光猝滅效率大于Tyr的熒光猝滅效率，結(jié)合2.2節(jié)得出的結(jié)論：加入PCA和FA導(dǎo)致BSA的內(nèi)源熒光紅移現(xiàn)象的發(fā)生，可以推斷PCA和FA導(dǎo)致BSA發(fā)生熒光猝滅的主要原因是Trp殘基的熒光發(fā)生了猝滅。庹潯等[31]研究發(fā)現(xiàn)，小分子物質(zhì)與主要結(jié)合在BSA的IIA或IIIA結(jié)構(gòu)域中，IIA結(jié)合域含有Trp213、Tyr262殘基，IIIA結(jié)構(gòu)域含有Tyr400、Tyr410、Tyr451、Tyr496殘基。2.3.2節(jié)發(fā)現(xiàn)，PCA和FA與BSA均只有1 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合同步熒光的結(jié)果，PCA和FA使BSA熒光發(fā)生猝滅的原因主要是導(dǎo)致Trp殘基的熒光發(fā)生猝滅，推測(cè)PCA和FA與BSA的結(jié)合位點(diǎn)可能在IIA結(jié)構(gòu)域的Trp213殘基附近。

圖7 PCA與BSA相互作用的同步熒光光譜及λem的變化Fig.7 Synchronous fluorescence spectra of PCA-BSA interactions and λem shift

圖9、10分別為PCA、FA與BSA相互作用的分子模擬結(jié)果圖，結(jié)合能量分別為－5.1、－6.3 kcal/mol。由圖9A可知，PCA與BSA形成了4 個(gè)常規(guī)氫鍵（O···H—X），其包括：PCA酚羥基的氫與Asp450的羧基氧形成氫鍵，鍵長為3.04 ?；PCA的2 個(gè)酚羥基氧與Ser343側(cè)鏈的羥基的氫分別形成2 個(gè)氫鍵，鍵長分別為4.31、4.32 ?；PCA醛基的氧與Trp213吲哚基上的氨基的氫形成氫鍵，鍵長為5.12 ?，這4 個(gè)氫鍵加強(qiáng)了相互作用過程中非共價(jià)結(jié)合的強(qiáng)度，穩(wěn)定了PCA與BSA復(fù)合物的空間構(gòu)象[32]。同時(shí)，PCA的苯環(huán)與BSA的疏水性氨基酸Val342的丙基側(cè)鏈形成了疏水鍵，鍵長為5.03 ?，有利于維持PCA和BSA作用部位的空間構(gòu)象。另外，PCA的苯環(huán)分別與Arg194帶正電荷的胍基和Asp450帶負(fù)電荷的羧基基于π-陽離子和π-陰離子作用而結(jié)合，鍵長分別為6.30、4.07 ?。此外，PCA與BSA的Leu197、Arg198、Ala341、Glu449、Ser453、Leu454殘基形成了范德華力，也對(duì)復(fù)合物的空間構(gòu)象有很大的支持作用。

圖8 FA與BSA相互作用的同步熒光光譜及λem的變化Fig.8 Synchronous fluorescence spectra of FA-BSA interactions and λem shift

圖9 PCA與BSA相互作用的分子對(duì)接圖Fig.9 Molecular docking diagram of PCA with BSA

2.5 分子對(duì)接結(jié)果分析

由圖9A、10A可知，PCA和FA主要靠氫鍵和范德華力與BSA結(jié)合，與2.3.3節(jié)所得結(jié)論一致。由圖9B、10B可知，PCA和FA在BSA上的最佳結(jié)合位點(diǎn)在IIA結(jié)合域和IIIA結(jié)合域之間，且距離IIA結(jié)合域更近，這與2.4節(jié)的推測(cè)一致。PCA和FA分別與Trp213靠氫鍵作用而結(jié)合，如圖9D、10D所示，其結(jié)合在Trp213及其周圍的疏水性殘基形成的疏水口袋中，此現(xiàn)象解釋了PCA和FA導(dǎo)致BSA內(nèi)源熒光發(fā)生猝滅的原因，進(jìn)一步驗(yàn)證了光譜實(shí)驗(yàn)的結(jié)論。另外，由圖9A、10A還可知，PCA比FA距離BSA的Trp213更近，其對(duì)應(yīng)關(guān)系為0.512 nm＜0.518 nm，根據(jù)Forster[33]的非輻射能量轉(zhuǎn)移機(jī)理可知，雖然PCA和FA均可被BSA貯存、轉(zhuǎn)運(yùn)，但PCA更容易被BSA貯存并運(yùn)輸。

圖10 FA與BSA相互作用的分子對(duì)接圖Fig.10 Molecular docking diagram of FA with BSA

由圖10A可知，F(xiàn)A與BSA分子形成了4 個(gè)常規(guī)氫鍵（O···H—X）包括：FA的羧基氫與Val481的羧基氧形成氫鍵，鍵長為4.09 ?；FA的羧基氧分別與Arg483、Arg484的氨基氫形成氫鍵，鍵長分別為5.32、4.89 ?；FA的羰基氧與Arg484的氨基氫形成氫鍵，鍵長為5.12 ?。同時(shí)，F(xiàn)A酚羥基上電負(fù)性的氧與Trp213吲哚基上的雙鍵碳形成了碳?xì)滏I（O···CH2＝CH2），鍵長為5.18 ?。4 個(gè)氫鍵對(duì)維持FA與BSA形成復(fù)合物的穩(wěn)定起關(guān)鍵作用。另外，F(xiàn)A的苯環(huán)分別與BSA的疏水性氨基酸Leu197、Leu346、Leu480、Val481的烴基側(cè)鏈形成了4 個(gè)疏水鍵，鍵長分別為6.69、6.39、5.05、4.80 ?，其減少了疏水性氨基酸與水的作用，有助于維護(hù)FA與BSA形成復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)。此外，F(xiàn)A與BSA的Ser201、Val342、Ser343、Arg347、Ser453、Leu456、Asn482、Pro485殘基形成了范德華力。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)利用光譜法和分子對(duì)接技術(shù)研究了PCA和FA分別與BSA的相互作用。紫外光譜發(fā)現(xiàn)，298 K時(shí)PCA和FA均會(huì)導(dǎo)致BSA的特征吸收峰強(qiáng)度和波長發(fā)生改變。熒光光譜的研究表明PCA和FA均會(huì)導(dǎo)致BSA的內(nèi)源熒光發(fā)生靜態(tài)猝滅，λem紅移，且PCA對(duì)BSA的作用更明顯；PCA和FA在BSA上均只有1 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，且PCA與BSA之間的結(jié)合能力強(qiáng)于FA與BSA的結(jié)合；由于ΔG、ΔS、ΔH值均小于0，所以PCA和FA主要靠氫鍵和范德華力與BSA形成穩(wěn)定復(fù)合物，且此過程自發(fā)進(jìn)行。同步熒光光譜的結(jié)果說明，PCA和FA的加入均會(huì)影響B(tài)SA的Tyr殘基或Trp殘基的微環(huán)境，并導(dǎo)致Tyr和Trp的熒光發(fā)生猝滅，且Trp的熒光猝滅效率大于Tyr的熒光猝滅效率。分子對(duì)接進(jìn)一步驗(yàn)證了光譜實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，并發(fā)現(xiàn)PCA、FA在BSA上的最佳結(jié)合位點(diǎn)在IIA、IIIA結(jié)合域之間的疏水空腔中，且距離IIA結(jié)合域更近，同時(shí)因?yàn)镻CA比FA距離BSA的Trp213更近，其對(duì)應(yīng)關(guān)系為0.512 nm＜0.518 nm，由此推測(cè)PCA更容易被BSA貯存運(yùn)輸。