朱 友，董洪權(quán)，李夢羽，張 姝，周希喬*

1南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科，江蘇 南京 210029；2中大醫(yī)院江北院區(qū)消化內(nèi)科，江蘇 南京 210044；3南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，4臨床醫(yī)學(xué)研究院，江蘇 南京 210029

大量研究表明，中樞對外周器官的調(diào)控可以通過各種神經(jīng)肽、神經(jīng)激素和神經(jīng)遞質(zhì)實(shí)現(xiàn)，其中下丘腦-垂體-靶腺軸在調(diào)節(jié)外周的能量代謝、生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用［1］。肝臟是糖、氨基酸、脂質(zhì)和膽固醇等營養(yǎng)素代謝中心，也參與維持免疫系統(tǒng)平衡，是許多生理病理過程的關(guān)鍵樞紐，在消化系統(tǒng)中具有重要地位［2］。近年來，中樞神經(jīng)系統(tǒng)在肝臟調(diào)節(jié)代謝中的作用引起了越來越多的關(guān)注［3］。機(jī)體的代謝狀態(tài)與甲狀腺激素水平息息相關(guān)，甲狀腺激素通過靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控來實(shí)現(xiàn)肝臟脂質(zhì)及能量穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)［4］。

肥大細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中普遍存在，主要位于丘腦-下丘腦區(qū)［5］，通過分泌大量血管活性物質(zhì)、細(xì)胞因子和蛋白酶等參與過敏和局部炎癥反應(yīng)［6］，可能在神經(jīng)免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用［7］。盡管有研究發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和炎性肝臟疾病具有相關(guān)性［8］，但神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的特異性細(xì)胞群在肝臟炎癥中的作用研究甚少。因此，本研究旨在闡述腦內(nèi)的肥大細(xì)胞在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的肝臟炎癥中的調(diào)節(jié)作用，并探討這種調(diào)節(jié)作用是否與下丘腦-垂體-甲狀腺（hypothalamic-pituitary-thyroid，HPT）軸有關(guān)。

1 材料和方法

1.1 材料

雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（220～250 g），購自南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動物中心。在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下［溫度（25±2）℃，相對濕度（60±10）%，室內(nèi)換氣12～18 次/h，室內(nèi)光/暗循環(huán)12 h］飼養(yǎng)，每籠5 只。適應(yīng)1周后開始本研究，并按照正常的飲食和水隨意喂養(yǎng)。本研究由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利倫理委員會批準(zhǔn)（IACUC-2104041），所有實(shí)驗(yàn)均按照中華人民共和國國家科學(xué)技術(shù)委員會制定的《實(shí)驗(yàn)動物管理條例》進(jìn)行。LPS、色甘酸鈉均購自美國Sigma 公司。BCA 蛋白檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。兔多克隆NF-κB 抗體、c-JNK抗體、p-JNK抗體、p38抗體、p-p38抗體、ERK抗體、p-ERK抗體、AKT抗體、p-AKT抗體、Lamin B抗體及兔單克隆GAPDH 抗體、羊抗兔二抗均購于美國Cell Signaling 公司。腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）、三碘甲狀腺原氨酸（triiodothyronine，T3）和甲狀腺素（thyroxine，T4）ELISA試劑盒購于美國R&D公司。

1.2 方法

1.2.1 動物造模和給藥

將大鼠隨機(jī)分為5組，分別為對照組（Ctr）、LPS造模30 min 組（LPS 30 min）、LPS 造模24 h 組（LPS 24 h）、色甘酸鈉+LPS 30 min組（cro+LPS 30 min）、色甘酸鈉+LPS 24 h組（cro+LPS 24 h），每組12只。

由于腦內(nèi)肥大細(xì)胞富集于下丘腦區(qū)域，肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑色甘酸鈉腦立體定位給藥于單側(cè)下丘腦區(qū)域。大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉后，被固定在腦立體定位儀（Stoelting Instruments 公司，美國）中，并使用加熱墊保持在37 ℃。給藥套管定位在右側(cè)下丘腦中，位置如下［9］：前囟右1.80 mm，前囟后1.90 mm，前囟下深8 mm，傾斜角度為10°。手術(shù)后，待動物自然清醒分籠飼養(yǎng)，每天對動物進(jìn)行套管檢查。14 d 后，色甘酸鈉組大鼠經(jīng)套管給予2 μL 色甘酸鈉（100 μg/μL）預(yù)處理。其余組大鼠用2 μL 無菌生理鹽水預(yù)處理。預(yù)處理30 min后，4組實(shí)驗(yàn)組大鼠腹腔注射LPS（1 mg/kg），而對照組注入無菌生理鹽水。LPS注射30 min或24 h后，用50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠，然后處死。收集大鼠大腦、肝臟和血液樣本，所有樣本均按要求儲存。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

采用ELISA 方法測定TNF-α、IL-6、TSH、T3 和T4，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.3 病理組織學(xué)檢查

用常規(guī)方法將10%福爾馬林固定石蠟包埋的肝組織切片分為4 μm切片，用蓋玻片固定于載玻片上。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案，用蘇木精和伊紅（HE）對每個固定肝臟的代表性切片進(jìn)行染色。利用Leica DM2500顯微鏡和圖像分析顯微系統(tǒng)對切片進(jìn)行觀察。由同一位有經(jīng)驗(yàn)的組織病理學(xué)家以盲法提供所有的組織學(xué)分析。

1.2.4 蛋白免疫印跡分析

100 mg肝臟標(biāo)本在200 μL RIPA裂解緩沖液中勻漿，置于冰上保存30 min，然后在4 ℃，12 000g離心15 min。采用BCA 蛋白檢測試劑盒測定上清液中的蛋白含量。蛋白質(zhì)（60 μg）用樣品緩沖液變性，SDS-PAGE電泳分離，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入一抗在4 ℃下孵化過夜，然后加入抗兔二抗孵育1 h，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影蛋白條帶。每個免疫印跡實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 色甘酸鈉抑制LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷

LPS可以同時引起中樞和外周的應(yīng)激反應(yīng)［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，外周給予LPS后，可以誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞的損傷。如圖1 所示，對照組肝臟切片顯示正常的小葉結(jié)構(gòu)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)。LPS（1 mg/kg）腹腔注射后30 min和1 h，肝臟切片顯示明顯的病理變化，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、局灶性壞死、纖維化和炎癥細(xì)胞浸潤，以及有廣泛的門靜脈炎癥出現(xiàn)。但預(yù)先給予肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑色甘酸鈉預(yù)處理后再注入LPS，肝臟的病變明顯減弱，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、局灶性壞死、纖維化和門靜脈炎癥區(qū)域減少。這一結(jié)果表明，腦室內(nèi)給予肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑色甘酸鈉阻斷腦肥大細(xì)胞的脫顆粒，可減輕LPS誘導(dǎo)的大鼠肝臟炎癥。

圖1 色甘酸鈉對LPS誘導(dǎo)的肝臟組織病理改變的影響（HE，×200）Figure 1 Effects of cromolyn on LPS-induced liver histopathological changes（HE，×200）

2.2 色甘酸鈉可以降低LPS誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6水平

ELISA法測定血清和肝組織中TNF-α和IL-6水平。如圖2A 所示，與對照組相比，LPS 處理30 min后血清TNF-α和IL-6水平顯著升高（P＜0.01），24 h時下降，但仍高于對照組（P＜0.05）。然而，色甘酸鈉預(yù)處理30 min顯著降低了LPS誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6 分泌增加（P＜0.05）。進(jìn)一步檢測肝標(biāo)本中TNFα和IL-6水平，如圖2B所示，在LPS注射后30 min和24 h，大鼠肝臟中的TNF-α和IL-6水平顯著升高（P＜0.01）。色甘酸鈉預(yù)處理30 min 減輕了LPS 作用30 min誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生（P＜0.05）及LPS作用24 h誘導(dǎo)的肝臟TNF-α和IL-6水平的升高（P＜0.01）。

圖2 色甘酸鈉降低LPS誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6水平Figure 2 Cromolyn reduced TNF-α and IL-6 levels induced by LPS

2.3 色甘酸鈉緩解LPS 誘導(dǎo)的大鼠HPT 軸激素水平的改變

我們推測肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑色甘酸鈉減輕肝臟炎癥的作用可能與甲狀腺激素水平有關(guān)。ELISA法測定血清和下丘腦標(biāo)本中TSH、T3、T4 水平。如圖3A 所示，與對照組相比，腹腔注射LPS（1 mg/kg）后30 min或24 h顯著降低血清TSH水平（與對照組相比，分別降低了34.46%或41.61%，P＜0.01）和T3水平（與對照組相比，分別降低了31.48%或38.17%，P＜0.05）；LPS 作用30 min 有增加血清中T4水平的趨勢，但無顯著性差異（與對照組相比，增加了21.77%），LPS 作用24 h 顯著增加血清中T4 水平（與對照組相比，增加了24.29%，P＜0.05）。然而，色甘酸鈉（200 μg）可以緩解LPS 作用24 h 引起的血清中TSH 和T3 水平降低，以及T4 水平升高（P＜0.05）。但只能緩解LPS 作用30 min 引起的TSH 升高，對T3 和T4 水平無顯著影響；如圖3B 所示，腹腔注射LPS（1 mg/kg）后30 min 顯著降低了下丘腦中TSH 水平（與對照組相比，降低了18.63%，P＜0.05），但是LPS 作用24 h 對下丘腦中TSH 有抑制作用但無顯著性差異（與對照組相比，降低了22.25%）。LPS作用30 min對下丘腦T3水平無顯著影響（與對照組相比，降低了8.24%），但LPS作用24 h顯著抑制下丘腦T3 水平（與對照組相比，降低了26.82%，P＜0.05）。LPS 作用30 min 和24 h 均顯著增加下丘腦中T4 的水平（與對照組相比，分別增加了46.93%或32.45%，P＜0.05）。色甘酸鈉可以緩解LPS作用30 min誘導(dǎo)的下丘腦中TSH水平的減少和部分緩解T4 水平的增高（P＜0.05）。同時色甘酸鈉可以緩解LPS 作用24 h 引起的下丘腦中T3 水平的下降和T4 水平的增高（P＜0.05）。這些結(jié)果表明，腦內(nèi)肥大細(xì)胞可能通過HPT 軸對肝臟炎癥進(jìn)行調(diào)節(jié)。

圖3 色甘酸鈉對HPT軸功能的影響Figure 3 Effects of cromolyn on the hypothalamic-pituitary-thyroid axis

2.4 色甘酸鈉抑制LPS 誘導(dǎo)的肝臟AKT、MAPK 和NF-κB信號通路的激活

NF-κB是一種主導(dǎo)炎癥的轉(zhuǎn)錄因子，一旦激活，NF-κB 發(fā)生核轉(zhuǎn)位，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［11］。我們檢測了色甘酸鈉對NF-κB激活的影響。與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠LPS 腹腔注射30 min 和24 h后，肝組織細(xì)胞核中NF-κB表達(dá)顯著增加，但均可以被色甘酸鈉所抑制，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖4）。AKT 和MAPK 是主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的通路效應(yīng)因子，負(fù)責(zé)促炎因子的合成和產(chǎn)生，MAPK主要包括以下家族成員：細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinases，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinases，JNK）和p38MAPK［12］。LPS 處理可導(dǎo)致肝內(nèi)AKT、p38 和ERK 的快速磷酸化。與對照組相比，在LPS 注射后30 min 和24 h，AKT、p38 和ERK 均被激活發(fā)生磷酸化。然而，JNK僅在LPS 注射后30 min 發(fā)生磷酸化（P＜0.05，圖4）。色甘酸鈉預(yù)處理顯著抑制了肝臟中LPS 作用30 min 和24 h 時引起的MAPK 活化。這些結(jié)果表明，色甘酸鈉可以抑制LPS 誘導(dǎo)的MAPK、AKT 和NF-κB肝臟信號通路的激活。

圖4 色甘酸鈉抑制LPS誘導(dǎo)的MAPK信號通路和NF-κB活化Figure 4 Cromolyn inhibits LPS induced MAPK signaling pathway and NF-κB activation

3 討論

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）疾病譜包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化及肝癌，已成為嚴(yán)重威脅人類健康的全球性疾病，是美國肝移植的第一大原因，現(xiàn)也超越病毒性肝炎成為我國慢性肝損傷的第一大原因。LPS 作為細(xì)菌代謝的主要產(chǎn)物，通過腸肝循環(huán)經(jīng)門靜脈進(jìn)入肝臟，導(dǎo)致TNF-α和IL-6 等炎癥因子生成增加，進(jìn)而引起肝細(xì)胞損傷、變性、凋亡，參與NAFLD 的發(fā)生發(fā)展［13-15］。本研究也證實(shí)了腹腔注射LPS 可以引起肝臟炎癥，以及血清和肝臟組織中炎性因子水平的增高。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射LPS 可以誘導(dǎo)大鼠下丘腦的肥大細(xì)胞激活，而肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑可以抑制這種激活［16］。在本研究中我們也發(fā)現(xiàn)下丘腦定位給予肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑色甘酸鈉可以抑制LPS引起的外周血和肝臟中炎性因子水平的上升。由于血腦屏障的存在，腦定位給予的色甘酸鈉無法影響到肝臟中的肥大細(xì)胞，因此色甘酸鈉肝臟炎癥的這種抑制作用，來自于穩(wěn)定腦內(nèi)肥大細(xì)胞。我們還發(fā)現(xiàn)色甘酸鈉作用30 min和24 h均可以抑制LPS引起的炎性因子生成，說明腦內(nèi)肥大細(xì)胞對于肝臟炎癥的作用是快速且持續(xù)的。本研究結(jié)果表明，腦內(nèi)肥大細(xì)胞在調(diào)節(jié)肝臟炎癥中發(fā)揮了作用。

大量研究證實(shí)LPS可以誘導(dǎo)下丘腦和垂體激素發(fā)生代謝改變［17-18］。但是恢復(fù)下丘腦和垂體激素水平是否能緩解LPS誘導(dǎo)的肝臟炎癥尚不清楚。甲狀腺激素的釋放受HPT軸的嚴(yán)密監(jiān)督，甲狀腺激素與炎癥之間的相互聯(lián)系［19］，盡管已廣為人知，但尚未得到充分研究。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在LPS引起的肝臟炎癥過程中，血清和下丘腦中TSH和T3激素水平顯著下降而T4水平顯著升高，這表明LPS誘導(dǎo)了腦神經(jīng)遞質(zhì)改變和HPT 軸的激活。富含肥大細(xì)胞的下丘腦區(qū)是HPT軸的核心區(qū)域。本研究還發(fā)現(xiàn)，下丘腦內(nèi)給予肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑色甘酸鈉可以恢復(fù)LPS誘導(dǎo)的激素水平改變，并抑制LPS 誘導(dǎo)的肝臟炎癥。說明中樞神經(jīng)系統(tǒng)中肥大細(xì)胞對肝臟炎癥的調(diào)節(jié)作用可能是通過HPT軸實(shí)現(xiàn)的。

NF-κB信號通路參與了炎癥反應(yīng)［20］。一旦激活，NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，色甘酸鈉抑制LPS 誘導(dǎo)的肝臟NF-κB 激活。AKT和MAPK通路也參與了LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，我們進(jìn)一步評估了色甘酸鈉對AKT和MAPK信號通路的影響，發(fā)現(xiàn)色甘酸鈉抑制了LPS 誘導(dǎo)的肝臟中AKT 和MAPK 的激活。這進(jìn)一步說明中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞在調(diào)節(jié)肝臟炎癥促炎因子信號通路中發(fā)揮作用，是否涉及其他促炎因子及信號通路，尚待后續(xù)的實(shí)驗(yàn)深入研究。

綜上所述，本研究表明脂多糖可引起肝臟炎癥，穩(wěn)定腦內(nèi)肥大細(xì)胞可能通過HPT軸抑制脂多糖誘導(dǎo)的肝臟炎癥。因此，進(jìn)一步深入研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞激活在肝臟炎癥中的作用機(jī)制，將為肝臟炎癥相關(guān)性疾病的預(yù)防和治療提供新的思路。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于將肝臟炎性的調(diào)節(jié)與下丘腦中肥大細(xì)胞的激活相聯(lián)系，中樞神經(jīng)系統(tǒng)對肝臟炎癥的調(diào)節(jié)作用為治療炎癥性肝病拓展了治療思路。