吳興富，焦芳嬋，馮智宇，陳學(xué)軍，張光海，李永平

云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，昆明市五華區(qū)圓通街33號(hào) 650021

煙草種質(zhì)資源是新品種選育的材料基礎(chǔ)，種質(zhì)資源遺傳多樣性可反映其遺傳背景、育種潛力和利用價(jià)值，遺傳多樣性研究對發(fā)掘利用資源、親本選擇、拓寬育成品種遺傳基礎(chǔ)和保護(hù)優(yōu)異種質(zhì)具有重要意義［1]。在煙草種質(zhì)資源遺傳多樣性研究方面，基于分子標(biāo)記的遺傳多樣性研究報(bào)道較多［2-5]，表型遺傳多樣性研究報(bào)道較少［5-7]，但這些研究未涉及煙葉物理特性?？緹熚锢硖匦宰鳛闊熑~品質(zhì)的重要組成部分，其中含梗率、填充值和平衡含水率等是卷煙加工性能的重要指標(biāo)，直接影響卷煙加工工藝、產(chǎn)品風(fēng)格、成本及經(jīng)濟(jì)效益［8]。目前，烤煙物理特性相關(guān)研究主要集中在不同品種煙葉物理特性差異［9-10]、特定產(chǎn)區(qū)煙葉物理特性［11-12]以及物理特性與煙葉外觀品質(zhì)［13-14]、化學(xué)成分含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）［15-18]、感官品質(zhì)［19-20]的關(guān)系等方面。楊虹琦等［10]研究表明，同一栽培條件下不同烤煙品種煙葉含梗率存在顯著差異;尹啟生等［11]研究提出了我國烤煙中部葉的葉面密度、拉力、填充值、平衡含水率、含梗率、單葉質(zhì)量等物理特性指標(biāo)的范圍；付秋娟等［13]研究提出烤煙物理特性與外觀品質(zhì)關(guān)系密切。王建民等［18]試驗(yàn)認(rèn)為，填充值、葉面密度與總糖和還原糖呈負(fù)相關(guān)，平衡含水率與總植物堿呈負(fù)相關(guān)，填充值與總氮和氯量呈正相關(guān)，葉面密度與總植物堿和總氮呈正相關(guān)，平衡含水率與總糖和還原糖呈正相關(guān);劉陽等［20]研究表明，在較適宜范圍內(nèi)的單葉質(zhì)量、含梗率與感官品質(zhì)顯著相關(guān)。但有關(guān)烤煙種質(zhì)資源物理特性的遺傳多樣性研究尚鮮見報(bào)道。為此，采用檢測遺傳變異最傳統(tǒng)和直觀的表型性狀研究方法［21]，對269份烤煙資源C3F煙葉的6個(gè)物理特性指標(biāo)的表型進(jìn)行遺傳多樣性分析和R語言聚類分析，以期為烤煙物理特性優(yōu)異的種質(zhì)篩選、育種親本選擇以及品種改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)方法

2018年在云南石林板橋種植269份烤煙種質(zhì)資源，包括129份國內(nèi)種質(zhì)資源（編號(hào)1～129），140份國外種質(zhì)資源（編號(hào)130～269）。其中美國種質(zhì)資源102份（編號(hào)130～231）、其他來源種質(zhì)資源38份（編號(hào)232～269）。每份種質(zhì)資源種植50株，采用膜下小苗移栽，行距120 cm，株距50 cm，田間管理按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范操作。大田煙株中心花開放時(shí)打頂，煙葉適熟采收，采用烤煙生產(chǎn)中最常用的密集烤房（氣流下降式）和三段式烘烤工藝對參試煙葉進(jìn)行烘烤。煙葉烘烤結(jié)束后，每份種質(zhì)資源取C3F煙葉2 kg，用于物理特性指標(biāo)的測定。

1.2 物理特性指標(biāo)檢測

按照YQ-YS/T 1—2018標(biāo)準(zhǔn)方法［22]，測定參試種質(zhì)資源C3F煙葉的葉面密度、單葉質(zhì)量、拉力、平衡含水率、含梗率和填充值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel計(jì)算參試種質(zhì)資源6個(gè)物理特性指標(biāo)的最大值、最小值、極差、平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)（CV）。參照王繼師等［23]的方法，將每個(gè)指標(biāo)劃分為10級(jí)，從第1級(jí)＜X-2S到第10級(jí)≥X+2S，中間隔0.5S為1級(jí)。X為平均值，S為標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算各指標(biāo)每一級(jí)的相對頻率，然后按照公式（1）計(jì)算Shannon-Weaver遺傳多樣性指數(shù)（H′），并用各指標(biāo)多樣性指數(shù)的平均值表示一類或所有種質(zhì)資源的遺傳多樣性程度。

按YQ-YS/T 1—2018標(biāo)準(zhǔn)［22]中的西南煙區(qū)烤煙物理特性指標(biāo)評分賦值法（見表1），利用公式（2）計(jì)算參試種質(zhì)資源物理特性指標(biāo)分值［18]。

計(jì)算公式：

式中：H′為Shannon-Weaver遺傳多樣性指數(shù)；Pi為某指標(biāo)第i級(jí)的頻率；ln為自然對數(shù)。

式中：G為物理特性分值；Fi為第i個(gè)物理特性指標(biāo)的量化分值，各個(gè)指標(biāo)的量化分值由表1計(jì)算得出；Hi為第i個(gè)物理特性指標(biāo)的權(quán)重，葉面密度、單葉質(zhì)量、拉力、平衡含水率、含梗率和填充值的權(quán)重分別為0.14、0.20、0.21、0.08、0.17和0.20。

為便于描述，根據(jù)表1評分賦值，將物理特性指標(biāo)適宜性劃分為4檔，即評分賦值100、100～80、80～60、＜60的適宜性依次為最適宜、適宜、次適宜和不適宜，葉面密度、單葉質(zhì)量、拉力、平衡含水率、含梗率和填充值的最適宜范圍分別為70.0～75.0 g/m2、9.0～11.0 g、1.8～2.0 N、≥13.5%、≤25.0%、≥4.3 cm3/g，適宜范圍分別為60.0～70.0 g/m2或75.0～85.0 g/m2、7.0～9.0 g或11.0～13.0 g、1.4～1.8 N或2.0～2.4 N、12.0%～13.5%、25.0%～31.0%、3.9～4.3 cm3/g，各指標(biāo)次適宜和不適宜的范圍依此類推。

表1 烤煙物理特性指標(biāo)評分賦值（西南煙區(qū)）Tab.1 Assignment for physical characteristic indexes of flue-cured tobacco from southwest tobacco growing areas

利用R語言軟件，對269份種質(zhì)資源6個(gè)物理特性指標(biāo)進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理，用皮爾遜相關(guān)系數(shù)距離法（Pearson correlation distance）計(jì)算距離，然后用平均值進(jìn)行層次聚類。同時(shí)，采用完全隨機(jī)分析方法，對不同類別種質(zhì)資源和聚類分析的6個(gè)物理特性指標(biāo)和二級(jí)統(tǒng)計(jì)指標(biāo)均值進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（新復(fù)極差法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 參試種質(zhì)資源物理特性指標(biāo)描述性統(tǒng)計(jì)及頻率分布

參試種質(zhì)資源6個(gè)物理特性指標(biāo)統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表2）表明，變異系數(shù)以填充值最大（20.25%），平衡含水率最?。?.73%），平均為15.88%，說明物理特性指標(biāo)差異較大。6個(gè)指標(biāo)的遺傳多樣性指數(shù)以含梗率最大（2.050），填充值最?。?.934），平均為2.014，說明物理特性遺傳多樣性較豐富。同時(shí)，從各指標(biāo)均值適宜性（表2）來看，平衡含水率（17.0%）最適宜（＞13.5%），填充值（3.2 cm3/g）不適宜（＜3.4 cm3/g），葉面密度（83.8 g/m2）、單葉質(zhì)量（12.5 g）、拉力（2.1 N）和含梗率（28.7%）適宜。

表2 參試種質(zhì)資源的物理特性描述性統(tǒng)計(jì)及遺傳多樣性分析Tab.2 Descriptive statistics and genetic diversity analysis of physical characteristic of experimental germplasm resources

從6個(gè)物理特性指標(biāo)基于10級(jí)分類的頻率分布（圖1）來看，6個(gè)指標(biāo)并非平均分布，而是在不同數(shù)值范圍內(nèi)具有一定的集中性，葉面密度、單葉質(zhì)量、拉力、平衡含水率、含梗率和填充值的集中分布范圍分別為67.5～92.0 g/m2、10.2～13.7 g、2.1～2.5 N、16.5%～18.2%、24.3%～33.1%和2.6～3.5 cm3/g，分布頻率依次為56.9%、62.8%、57.6%、60.6%、71.0%和65.1%。從物理特性指標(biāo)適宜性來看，參試種質(zhì)資源葉面密度、單葉質(zhì)量、拉力、平衡含水率、含梗率和填充值最適宜范圍分布頻率分別為11.5%（31份）、18.6%（50份）、20.1%（54份）、99.3%（267份）、20.1%（54份）和9.7%（26份）?？梢姡瑓⒃嚪N質(zhì)資源中平衡含水率優(yōu)異的種質(zhì)資源豐富，填充值和葉面密度優(yōu)異的種質(zhì)資源相對匱乏，單葉質(zhì)量、拉力和含梗率優(yōu)異的種質(zhì)資源較豐富。

2.2 參試種質(zhì)資源物理特性的遺傳多樣性分析

從不同來源種質(zhì)資源（表3）來看，除單葉質(zhì)量外，其他5個(gè)指標(biāo)及物理特性分值的差異達(dá)到顯著或極顯著水平，國內(nèi)種質(zhì)資源的拉力大于其他種質(zhì)資源，含梗率高于美國種質(zhì)資源，填充值大于美國種質(zhì)資源，物理特性分值高于美國種質(zhì)資源，葉面密度小于美國和其他種質(zhì)資源，平衡含水率低于美國種質(zhì)資源。美國種質(zhì)資源的平衡含水率比其他種質(zhì)資源稍高，含梗率低于其他種質(zhì)資源，填充值小于其他種質(zhì)資源，物理特性分值略低于其他種質(zhì)資源。從遺傳多樣性指數(shù)看，國內(nèi)種質(zhì)資源中拉力、平衡含水率和填充值的H′略高于美國種質(zhì)資源，葉面密度的H′略低于美國種質(zhì)資源，單葉質(zhì)量、平衡含水率的H′略高于其他種質(zhì)資源，填充值的H′略低于其他種質(zhì)資源。美國種質(zhì)資源葉面密度、單葉質(zhì)量和含梗率的H′略高于其他種質(zhì)資源，拉力和填充值的H′略低于其他種質(zhì)資源。國內(nèi)種質(zhì)資源物理特性分值的H′（2.049）略高于美國種質(zhì)資源（1.956）和其他種質(zhì)資源（2.000），6個(gè)物理特性指標(biāo)的平均H′（1.979）略高于美國種質(zhì)資源（1.956）和其他種質(zhì)資源（1.932）?？梢?，國內(nèi)種質(zhì)資源物理特性指標(biāo)的遺傳多樣性比國外種質(zhì)資源稍豐富。

表3 不同來源種質(zhì)資源的物理特性遺傳多樣性①Tab.3 Genetic diversity of physical characteristics of germplasm resources from different sources

2.3 國內(nèi)地方和雜交選育種質(zhì)資源的物理特性遺傳多樣性差異分析

國內(nèi)種質(zhì)資源來源明確的72份地方種質(zhì)資源和40份雜交選育種質(zhì)資源的物理特性指標(biāo)見表4。方差分析結(jié)果表明，地方種質(zhì)資源和雜交選育種質(zhì)資源的各物理特性指標(biāo)間差異未達(dá)到顯著水平。從H′來看，地方種質(zhì)資源的葉面密度、單葉質(zhì)量、拉力、平衡含水率、含梗率和填充值的H′明顯高于雜交選育的種質(zhì)資源，同時(shí)，這6個(gè)指標(biāo)的平均H′和物理特性指標(biāo)分值H′亦高于雜交選育的種質(zhì)資源，表明國內(nèi)地方種質(zhì)資源物理特性遺傳多樣性比雜交選育種質(zhì)資源物理特性的遺傳多樣性豐富，在品種選育或改良中具有較好應(yīng)用前景。

表4 國內(nèi)地方和雜交選育種質(zhì)資源物理特性的遺傳多樣性Tab.4 Genetic diversity of physical characteristics of domestic local germplasm resources and hybrid breeding germplasm resources

2.4 參試種質(zhì)資源物理特性指標(biāo)聚類分析

利用R語言軟件對269份烤煙種質(zhì)資源6個(gè)物理特性指標(biāo)進(jìn)行層次聚類，在相似距離0.982處，可將參試種質(zhì)資源聚為4個(gè)類群（圖2），Ⅰ類群包括053、034等73份種質(zhì)資源，Ⅱ類群包括222、264等70份資種質(zhì)源，Ⅲ類群包括114、248等94份種質(zhì)資源，Ⅳ類群包括168、173等32份種質(zhì)資源，各類群種質(zhì)資源物理特性主要參數(shù)見表5。從表5可見，類群間6個(gè)聚類指標(biāo)和二級(jí)統(tǒng)計(jì)指標(biāo)物理特性分值的差異達(dá)極顯著水平。從物理特性指標(biāo)適宜性來看，4個(gè)類群種質(zhì)資源的平衡含水率均在最適宜范圍，其他指標(biāo)的適宜性在類群間存在差異，Ⅰ類群葉面密度、單葉質(zhì)量、拉力、含梗率適宜，填充值次適宜。Ⅱ類群拉力最適宜，葉面密度、單葉質(zhì)量適宜，含梗率、填充值次適宜。Ⅲ類群單葉質(zhì)量、拉力、含梗率適宜，葉面密度和填充值不適宜。Ⅳ類群拉力最適宜，含梗率適宜，葉面密度次適宜，單葉質(zhì)量、填充值不適宜。

表5 不同類群種質(zhì)資源物理特性指標(biāo)的差異分析Tab.5 Difference analysis of physical characteristic indexes of germplasm resources in various groups

物理特性分值是衡量煙葉物理特性好壞的重要指標(biāo)，分值越大，煙葉物理特性越好［22]。Ⅰ類群、Ⅱ類群種質(zhì)資源物理特性分值高于Ⅲ類群、Ⅳ類群，表明Ⅰ類群、Ⅱ類群種質(zhì)資源的物理特性優(yōu)于Ⅲ類群、Ⅳ類群。對物理特性具體指標(biāo)而言，含梗率越低越好，平衡含水率和填充值越大越好，葉面密度、單葉質(zhì)量和拉力均在適宜性范圍內(nèi)，煙葉物理特性指標(biāo)間存在復(fù)雜的相互關(guān)系。因此，在評價(jià)烤煙種質(zhì)資源物理特性時(shí)，除物理特性分值外，各指標(biāo)的適宜性也應(yīng)給予關(guān)注。進(jìn)一步分析表明，269份參試種質(zhì)資源中，92份種質(zhì)資源物理特性分值達(dá)80分以上，其聚在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ類群的種質(zhì)資源數(shù)分別為33份、47份、8份和4份，其中12份物理特性分值90分以上的種質(zhì)資源聚在Ⅰ類群（7份）和Ⅱ類群（5份），這12份種質(zhì)資源的主要物理特性參數(shù)見表6。福泉厚節(jié)巴和薄荷煙的葉面密度、金黃柳的單葉質(zhì)量、索馬里2號(hào)的含梗率次適宜，日本烤煙2的含梗率不適宜，這5份種質(zhì)資源物理特性分值高，但個(gè)別指標(biāo)適宜性存在欠缺。豐字6號(hào)、黃苗榆、B22、革新6號(hào)、牡單81-56、黑玉米棒子和鳳城黃金等7份種質(zhì)資源物理特性分值高，6個(gè)指標(biāo)均在最適宜或適宜范圍，這7份物理特性優(yōu)異的種質(zhì)資源可在品種選育或物理特性改良中根據(jù)育種目標(biāo)選擇利用。

表6 12份烤煙種質(zhì)資源的物理特性指標(biāo)比較Tab.6 Analysis of physical characteristic indexes of 12 flue-cured tobacco germplasm resources

3 討論

269份參試種質(zhì)資源物理特性指標(biāo)頻率分布和適宜性分布表明，平衡含水率優(yōu)異的種質(zhì)資源豐富，填充值、葉面密度優(yōu)異的種質(zhì)資源相對匱乏，單葉質(zhì)量、拉力、含梗率優(yōu)異的種質(zhì)資源較豐富，在烤煙種質(zhì)資源研究中，應(yīng)加強(qiáng)填充值和葉面密度優(yōu)異的種質(zhì)資源的收集鑒定。參試種質(zhì)資源6個(gè)物理特性指標(biāo)變異系數(shù)6.73%～20.25%，遺傳多樣性指數(shù)1.934～2.050、平均2.014，遺傳多樣性較豐富。同時(shí)，煙葉平衡含水率變異系數(shù)最低（小于10%），這與劉陽等［20]和李瑞麗等［24]研究結(jié)果一致。但有關(guān)平衡含水率變異系數(shù)低的原因還有待進(jìn)一步研究。

遺傳多樣性通常指種內(nèi)不同群體之間或一個(gè)群體內(nèi)不同個(gè)體的遺傳變異總和，種內(nèi)遺傳變異越豐富，對環(huán)境的適應(yīng)能力越強(qiáng)，其物種進(jìn)化的潛力越大。本試驗(yàn)中國內(nèi)種質(zhì)資源物理特性遺傳多樣性比國外資源稍豐富，國內(nèi)地方種質(zhì)資源物理特性遺傳多樣性比雜交選育種質(zhì)資源豐富。國內(nèi)種質(zhì)資源物理特性遺傳多樣性比國外資源稍豐富的原因，可能與煙草傳入我國后不同生態(tài)環(huán)境的長期馴化和非目標(biāo)多樣化選擇等有關(guān)。煙草傳入我國已有400多年，在長期的種植過程中，資源間的天然雜交、自然突變，以及不同種植區(qū)域農(nóng)民根據(jù)自己需求（如抗逆性好）進(jìn)行了選擇等，這種長期的環(huán)境馴化和非目標(biāo)多樣化選擇豐富了國內(nèi)種質(zhì)資源的遺傳多樣性。國內(nèi)地方種質(zhì)資源物理特性遺傳多樣性比雜交選育種質(zhì)資源豐富的原因，與長期人為定向選擇和保守的育種策略有關(guān)。煙草作為特殊的葉用經(jīng)濟(jì)作物，圍繞“優(yōu)質(zhì)、抗病”進(jìn)行育種選擇，長期的人為定向選擇導(dǎo)致煙草育種過度依賴骨干親本，且親本種質(zhì)資源遺傳背景狹窄［25-26]，進(jìn)而導(dǎo)致雜交選育品種遺傳多樣性降低。美國煙草育種也存在類似情況，為通過最低育種標(biāo)準(zhǔn)，煙草新品種選育基本是核心種質(zhì)間的雜交，美國20世紀(jì)40年代以前的37個(gè)農(nóng)家品種遺傳相似系數(shù)為0.758，20世紀(jì)90年代和21世紀(jì)前10年育成品種的遺傳相似系數(shù)分別為0.849和0.874，與農(nóng)家品種相比，雜交選育品種遺傳多樣性變低，遺傳基礎(chǔ)變窄［27]?？梢?，長期的人為定向選擇和保守的育種策略是導(dǎo)致雜交選育品種（或種質(zhì)資源）遺傳多樣性降低的主要原因。

烤煙物理特性受煙區(qū)生態(tài)環(huán)境［11-12]和烘烤過程［28]的影響，對本試驗(yàn)中7份烤煙物理特性優(yōu)異種質(zhì)資源進(jìn)行選擇利用時(shí)，要綜合分析煙區(qū)生態(tài)環(huán)境、烤房類型及烘烤工藝等與本試驗(yàn)條件的相似性，必要時(shí)可對其在當(dāng)?shù)氐奈锢硖匦员憩F(xiàn)進(jìn)行驗(yàn)證后再選擇利用。因此參試種質(zhì)資源在不同生態(tài)區(qū)域和不同烘烤條件下的物理特性的差異還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

269份烤煙種質(zhì)資源物理特性遺傳多樣性較豐富，平衡含水率指標(biāo)優(yōu)異的種質(zhì)資源豐富，填充值和葉面密度指標(biāo)優(yōu)異的種質(zhì)資源相對匱乏，單葉質(zhì)量、拉力和含梗率指標(biāo)優(yōu)異的種質(zhì)資源較豐富。國內(nèi)種質(zhì)資源物理特性遺傳多樣性比國外種質(zhì)資源稍豐富，國內(nèi)地方種質(zhì)資源物理特性遺傳多樣性比雜交選育種質(zhì)資源豐富。豐字6號(hào)、黃苗榆、B22、革新6號(hào)、牡單81-56、黑玉米棒子和鳳城黃金等7份烤煙物理特性指標(biāo)優(yōu)異的種質(zhì)資源可供品種選育或物理特性改良時(shí)加以利用。