段燦燦，王清純，趙澤粉，蔡秋雪，劉 方，晏仁義，何天目，王雅芝，李桂琳，張建永,

（1.遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義 563003；2.遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州遵義 563009；3.雙鶴藥業(yè)（海南）有限責(zé)任公司，海南?？?570311；4.云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，云南瑞麗 678600）

神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括神經(jīng)退行性疾病、神經(jīng)自身免疫病、神經(jīng)系統(tǒng)感染等在內(nèi)的一組系統(tǒng)性疾病[1]。隨著社會(huì)的老齡化嚴(yán)重，神經(jīng)系統(tǒng)疾病已成為導(dǎo)致人類死亡和殘疾的主要原因之一。據(jù)調(diào)查，截止到2017 年5 月，全球約4700 萬阿爾茲海默癥患者，預(yù)計(jì)到2030 年，將達(dá)到7470 萬[2]。目前臨床治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物雖然較多，但是藥物會(huì)造成一定的不良反應(yīng)，如心理狀態(tài)異常、支氣管痙攣和血管性水腫等[3]。特別是阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病目前仍無較理想的藥物可用，因此研發(fā)新的神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物具有重要意義。

金釵石斛（Dendrobium nobileLindl）為蘭科植物金釵石斛的莖，因形像古代頭上的發(fā)釵而得名。主產(chǎn)廣西、貴州等地，具滋陰清熱，生津止渴等功效。目前從金釵石斛中已經(jīng)分離到了生物堿、酚類、黃酮類、等生物活性成分[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)，金釵石斛具有抗腫瘤、抗衰老、增強(qiáng)免疫、改善記憶及抗白內(nèi)障等多種藥理活性[5]。如金釵石斛提取物能有效改善小鼠抑郁模型的行為學(xué)表現(xiàn)，提高小鼠腦內(nèi)的多巴胺和5-羥色胺水平[6]；金釵石斛可以通過提高超氧化物歧化酶水平及降低過氧化脂質(zhì)含量達(dá)到提高記憶的效果[7]；金釵石斛生物總堿對(duì)脂多糖誘導(dǎo)大鼠海馬tau蛋白的高度磷酸化和炎癥等具有明顯的改善作用，同時(shí)可減輕海馬周圍神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[8]；金釵石斛多糖可保護(hù)神經(jīng)元免受炎癥因子的毒性作用，通過拮抗脂多糖對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元混合培養(yǎng)體系，降低炎癥因子表達(dá)及抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活等機(jī)制[9?11]。因此，金釵石斛在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有很大的潛力，亟需深入挖掘金釵石斛治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的活性成分和作用靶點(diǎn)，厘清金釵石斛治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在治療靶點(diǎn)及分子機(jī)制。

由于中藥多成分-多靶點(diǎn)-多通路的特點(diǎn)，難以厘清其具體治病機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是由系統(tǒng)生物學(xué)及多向藥理學(xué)等多學(xué)科的交叉融合，運(yùn)用基因組學(xué)、代謝組學(xué)、可視化和分子對(duì)接等多種技術(shù)，揭示“化合物-基因-通路-疾病”之間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，多維度分析疾病的致病基礎(chǔ)，探索藥物干預(yù)后的藥理學(xué)機(jī)制，并通過相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證、評(píng)估藥物的有效性、作用機(jī)制及不良反應(yīng)，從而發(fā)現(xiàn)高效、低毒的藥物[12]。如有研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，探討了二至丸預(yù)防阿爾茨海默病（Alzheimer's disease,AD）的物質(zhì)基礎(chǔ)和機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了二至丸治療AD的有效成分可能是槲皮素、香葉醇、β-谷甾醇、橙花醇和厄立地黃，其作用機(jī)制可能與Wnt、MAPK和PI3K-AKT-M Tor三種信號(hào)途徑有關(guān)[13]。有研究基于中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，分析得出四逆散可以通過調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體蛋白信號(hào)通路、cAMP系統(tǒng)神經(jīng)系統(tǒng)、神經(jīng)遞質(zhì)分泌等途徑發(fā)揮抗抑郁作用[14]。故本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索金釵石斛治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的分子機(jī)制，以期為后續(xù)深入研究其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及治療機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)（TCMSP）；PubChem數(shù)據(jù)庫；Chemical Book數(shù)據(jù)庫；ADMETlab數(shù)據(jù)庫；Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫；TargetNet數(shù)據(jù)庫；UniProt數(shù)據(jù)庫；比較毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫（CTD）；功能關(guān)聯(lián)蛋白網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫（STRING）；生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫（DAVID）；AutoDock Vina軟件；ChemBioDraw 13.0 軟件；Cytoscape 3.6.1軟件。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 金釵石斛化學(xué)成分的收集 檢索國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫，包括中國(guó)知網(wǎng)、萬方、數(shù)據(jù)庫SinoMed (http://www.sinomed.ac.cn)、Pubmed (http://pubmed.com.cutestat.com)和TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)[15?16]，得到金釵石斛中的活性成分。再利 用 Pubchem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)、Chemical Book（http://www.chemicalbook.com）和ADMETlab (http://admet.scbdd.com)數(shù)據(jù)庫等平臺(tái)驗(yàn)證其成分結(jié)構(gòu)，并采用ChemBioDraw13.0 軟件繪制其分子結(jié)構(gòu)，保存為“sdf”文件。

1.2.2 金釵石斛成分潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 采用TargetNet(http://targetnet.scbdd.com) 在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)成分的潛在靶點(diǎn)，以準(zhǔn)確性（Accuracy，AUC）≥0.7 為遴選條件，其中AUC代表采用模型方法的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率，篩選Uniprot_ID、Protein、Prob（>0.9）等靶點(diǎn)的作用的潛在靶點(diǎn)群，同時(shí)本研究是針對(duì)人體，故再利用Uniprot (http://www.uniprot.org)數(shù)據(jù)庫篩選人源的潛在靶點(diǎn)。

1.2.3 金釵石斛成分-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò) 采用Cytoscape 3.6.1 軟件，構(gòu)建金釵石斛“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用Network analysis插件分析網(wǎng)絡(luò)特征指標(biāo)度（degree）和介數(shù)（Betweenness），獲取主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.2.4 靶點(diǎn)-疾病互作網(wǎng)絡(luò) 將靶點(diǎn)導(dǎo)入CTD數(shù)據(jù)庫（https://ctdbase.org/tools/batchQuery.go）進(jìn)行相關(guān)疾病的分析，剔除非神經(jīng)系統(tǒng)疾病的靶點(diǎn)。采用Cytoscape 3.6.1 軟件，構(gòu)建“靶點(diǎn)-疾病”互作網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步以Network analysis插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)的Degree和Betweenness進(jìn)行分析。同時(shí)根據(jù)人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（http://www.omim.org）對(duì)不同類別疾病歸納和分類。

1.2.5 作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò) 將獲取的相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病靶點(diǎn)進(jìn)行整合，采用STRING (https://stringdb.org)數(shù)據(jù)庫在線分析，獲取靶點(diǎn)之間的相互作用數(shù)據(jù)，導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1 軟件，重新構(gòu)建金釵石斛潛在作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，利用Analyze network工具對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，采用gnoyiacGenerate style from statistics工具根據(jù)degree值的大小對(duì)靶點(diǎn)的大小和顏色進(jìn)行變換。

1.2.6 靶點(diǎn)蛋白的基因功能和通路分析 本研究采用在線分析數(shù)據(jù)庫DAVID（https://david.ncifcrf.gov）對(duì)金釵石斛作用的靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，基于ClueGO插件進(jìn)行基因功能及KEGG通路富集分析。設(shè)定閾值P-value<0.05，篩選主要靶點(diǎn)信號(hào)通路。并使用Omicshare（http://www.omicshare.com/tools/index.php/Home/Soft/trend）在線分析平臺(tái)對(duì)富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化，進(jìn)一步整合探析金釵石斛治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要信號(hào)通路，揭示金釵石斛治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在分子機(jī)制。

1.2.7 分子對(duì)接 選擇成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中degree排名前6 的靶點(diǎn)，同時(shí)選擇金釵石斛degree排名前10 的成分，采用AutoDock Vina軟件，將靶點(diǎn)與成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，以其結(jié)合能（Binding energy）評(píng)價(jià)化合物和靶點(diǎn)的結(jié)合活性。一般認(rèn)為結(jié)合能越高，配體與受體的結(jié)合性越穩(wěn)定。當(dāng)結(jié)合能大于5.0，表明化合物靶點(diǎn)結(jié)合具有較好的結(jié)合活性。首先通過RCSB PDB（http://www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫獲取靶點(diǎn)蛋白晶體結(jié)構(gòu)，用OpenBabel軟件將成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)SDF格式轉(zhuǎn)化為PDB格式。使用AutoDock Vina得到對(duì)接活性位點(diǎn)、結(jié)合能和均方根偏差(RMSD)。最后運(yùn)用Pymol軟件對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 金釵石斛目標(biāo)化合物的篩選

本研究通過檢索中國(guó)知網(wǎng)、萬方、數(shù)據(jù)庫SinoMed(http://www.sinomed.ac.cn)、Pubmed (http://pubmed.com.cutestat.com)和TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)中報(bào)道的金釵石斛化學(xué)成分，共收集到47 個(gè)（表1）。

表1 金釵石斛中的化學(xué)成分信息Table 1 Chemical constituents of Dendrobium nobile

2.2 金釵石斛成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

如圖1 所示，金釵石斛“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)得到135 個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中47 個(gè)為化合物成分，88 個(gè)為預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。它們由946 條邊相連構(gòu)成一個(gè)完整的網(wǎng)絡(luò)，邊代表化合物和靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系，度值平均值為7，其中度值排名前6 的成分是Nobilin D（果香菊素D，degree=42）、Nobliomethylene（-，degree=38）、decumbic acid B（癸二酸B，degree=33）、(+)-dendrolactone（(+)-樹內(nèi)酯，degree=32）、(?)-denobilone A（(?)-二苯酮A，degree=30）和 Nobilin（果香菊素，degree=30），度值排名前6 個(gè)靶點(diǎn)分別是巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（MIF）、雌激素受體 2（ERS2）、芳香化酶（CYP19A1）、人乳腺癌抵抗蛋白（ABCG1）、Toll樣受體9（TLR9）、多巴胺受體-D5 抗原（DRD5），degree分別為37、37、35、33、32、32。

圖1 金釵石斛成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Composition target network of Dendrobium nobile

2.3 靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)分析

將靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入CTD數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相關(guān)疾病的分析，查詢靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)的疾病，刪除重復(fù)項(xiàng)后，列取前20 種疾病名稱及疾病分類，如表2 所示。再采用Cytoscape 3.6.1 軟件，構(gòu)建“靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，如圖2所示。

圖2 金釵石斛靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Target disease network of Dendrobium nobile

表2 金釵石斛前20 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)疾病名稱及疾病分類Table 2 Disease names and disease classification of the first 20 potential targets of Dendrobium nobile

2.4 金釵石斛作用靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

對(duì)金釵石斛成分的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行合并整合，同時(shí)刪除重復(fù)的作用靶點(diǎn)，總共得到88 個(gè)靶點(diǎn)蛋白，進(jìn)一步導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中在線分析，限定人源物種，獲取88 個(gè)靶點(diǎn)的相互蛋白作用關(guān)系，將結(jié)果整合后導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1 軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖，如圖3 所示。PPI網(wǎng)絡(luò)共包括84 個(gè)節(jié)點(diǎn)，1338 條邊，每一個(gè)節(jié)點(diǎn)表示一個(gè)靶點(diǎn)蛋白，節(jié)點(diǎn)越大、顏色越紅，正方形越大，其degree值變大；邊表示蛋白之間的關(guān)聯(lián)。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)，獲得 degree值排前 10 的關(guān)鍵蛋白分別為APP（degree=38）、SRC（degree=36）、CASP3（degree=34）、DRD2（degree=34）、TNF（degree=33）、PTGS2（degree=32）、OPRM1（degree=31）、CNR1（degree=31）、ADRA2A（degree=31）、HTR1A（degree=30），表明這些靶點(diǎn)蛋白在PPI網(wǎng)絡(luò)圖中的中心度較高，能與多個(gè)蛋白發(fā)生相互作用，提示其可能是金釵石斛作用的重要靶點(diǎn)。

圖3 金釵石斛潛在作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network of potential targets of Dendrobium nobile

2.5 GO(Gene ontology)生物進(jìn)程分析

將金釵石斛作用的88 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物進(jìn)程分析，得到生物進(jìn)程層級(jí)關(guān)系（如圖4 所示），共有759 個(gè)生物進(jìn)程，其中排名前10 的生物進(jìn)程（表3），主要涉及細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)、痛覺、對(duì)雌二醇的反應(yīng)、肽酰蘇氨酸磷酸化、阿片受體信號(hào)通路、慢性炎癥反應(yīng)等方面，提示金釵石斛可能調(diào)控以上生物進(jìn)程來治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

圖4 靶點(diǎn)的GO生物進(jìn)程層級(jí)關(guān)系Fig.4 The hierarchy of go biological process of target

表3 金釵石斛治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病靶點(diǎn)的生物進(jìn)程分析結(jié)果Table 3 Biological process analysis results of Dendrobium nobile in the treatment of nervous system diseases

2.6 KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析

采用DAVID在線分析平臺(tái)對(duì)金釵石斛作用的88 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果如圖5 所示。KEGG的富集程度主要通過影響因子（Rich factor，RF）、P值及參與調(diào)控通路上的基因個(gè)數(shù)進(jìn)行綜合分析，其中RF指差異表達(dá)的基因中位于該通路條目的基因數(shù)目與所有注釋基因中位于該通路條目的目的基因總數(shù)的比值，富集的程度隨RF大小變化。對(duì)結(jié)果整合分析發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)主要富集于Sphingolipid signaling pathway、Cocaine addiction以及Serotonergic synapse這三條信號(hào)通路。

圖5 前20 個(gè)KEGG通路富集氣泡圖（P<0.05）Fig.5 Enrichment bubble diagram of the first 20 KEGG pathways (P<0.05)

2.7 分子對(duì)接驗(yàn)證

為驗(yàn)證金釵石斛成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的準(zhǔn)確性，本研究采用AutoDock Vina軟件對(duì)11 個(gè)degree較大的成分和6 個(gè)靶點(diǎn)根據(jù)默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行分子對(duì)接，以結(jié)合能（Binding energy）作為篩選條件，結(jié)合能越小表明對(duì)接結(jié)果越好。對(duì)于多構(gòu)象的對(duì)接結(jié)果，篩選出結(jié)合能最低的對(duì)接構(gòu)象，如表4 所示。大部分化合物與分子靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)合能絕對(duì)值大于5.0，表明分子對(duì)接結(jié)果良好，驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。運(yùn)用Pymol軟件，根據(jù)結(jié)合能的大小選出每個(gè)靶點(diǎn)蛋白對(duì)接最好的化合物進(jìn)行可視化分析，結(jié)果如圖6 所示，其中ESR2 與化合物C25、MIF與化合物C42、CYP19A1 與化合物C32 均可以形成氫鍵。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步整合探析金釵石斛的藥效物質(zhì)提供理論參考。

表4 金釵石斛作用的4 個(gè)靶點(diǎn)與11 個(gè)成分的分子對(duì)接得分Table 4 Molecular docking scores of 4 targets and 11 components of Dendrobium nobile

圖6 ESR2、MIF、ABCG2、CYP19A1 與化合物結(jié)合能最低的最佳對(duì)接構(gòu)象Fig.6 The best docking conformation of ESR2,MIF,ABCG2,CYP19A1 and the compounds with the lowest binding energy

3 討論與結(jié)論

石斛作為藥用始見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，金釵石斛是藥用石斛主流品種之一，具有益胃生津、滋陰清熱的功效[17?18]。有研究發(fā)現(xiàn)金釵石斛葉總黃酮具有較好的抗氧化、抑制Aβ42 蛋白聚集及螯合金屬離子的能力，體外具有抗AD活性[19]；金釵石斛總堿對(duì)APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力具有改善作用[20]。然而其具體作用機(jī)制尚不清楚，因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)接和分子對(duì)接整合分析。

本研究通過構(gòu)建多元生物網(wǎng)絡(luò)，篩選到金釵石斛活性成分47 個(gè)，作用靶點(diǎn)88 個(gè)，富集疾病多與帕金森、阿爾茨海默癥及精神、記憶障礙等神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，可能與鞘脂信號(hào)通路和5-羥色胺突觸有關(guān)。根據(jù)degree的大小，成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)金釵石斛發(fā)揮作用來源的主要活性成分有Nobilin D（degree=42）、Nobliomethylene（degree=38 ）、decumbic acid B（degree=33）、（+）-dendrolactone（degree=32）、（?）-denobilone A（degree=30）和 Nobilin（degree=30）。表明這些成分可能是金釵石斛發(fā)揮治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。上述成分的實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)結(jié)果也進(jìn)一步佐證了預(yù)測(cè)，其中有研究發(fā)現(xiàn)Nobliomethylene可顯著增加貓免疫缺陷病毒模型誘導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能病理變化，如腦干聽覺誘發(fā)電位延遲[21]。但其他Nobilin D、decumbic acid B、（+）-dendrolactone、（?）-denobilone A、Nobilin的相關(guān)活性尚不清楚，亟需對(duì)其潛在靶點(diǎn)進(jìn)一步驗(yàn)證分析。進(jìn)一步探尋這些化合物的靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)分析可知，金釵石斛這些成分作用的核心靶點(diǎn)包括MIF（degree=37）、ERS2（degree=37）、CYP19A1（degree=35）、ABCG2（degree=33）、TLR9（degree=32）、DRD5（degree=32）等。目前，關(guān)于以上主要活性成分作用于核心靶點(diǎn)的研究的文獻(xiàn)報(bào)道較少，但分子對(duì)接結(jié)果顯示，MIF、ERS2、CYP19A1D等核心靶點(diǎn)能夠與Nobliomethylene、decumbic acid B、（?）-denobilone A等主要活性成分較好對(duì)接，因此，對(duì)金釵石斛中的活性化合物及作用機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis,MS）是一種進(jìn)行性免疫介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病。隨著時(shí)間的推移，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)炎癥和神經(jīng)退行性通路的慢性激活會(huì)導(dǎo)致永久性神經(jīng)功能障礙的累積。MIF是一種多功能細(xì)胞因子，在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（Experimental Allergic Encephalomyelitis,EAE）的MS小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)MIF在調(diào)節(jié)炎癥病理發(fā)展中樞神經(jīng)系統(tǒng)效應(yīng)器機(jī)制中起關(guān)鍵作用。在MS腦組織的檢查中，發(fā)現(xiàn)MIF在活躍炎癥區(qū)域高度表達(dá)，提示MIF可能對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)有深遠(yuǎn)的影響。這些研究說明了MIF在EAE期間促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)巨噬細(xì)胞活化和募集的能力：這兩種中樞神經(jīng)系統(tǒng)效應(yīng)器機(jī)制對(duì)EAE進(jìn)展至關(guān)重要。MIF對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞具有有效的促炎作用，并使與中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫介導(dǎo)的組織損傷相關(guān)的促炎基因表達(dá)譜極化[22?24]。有研究發(fā)現(xiàn)AD女性受試者中ESR2 等位基因（s4986938,rs867443）對(duì)AD具有顯著的保護(hù)作用，相反CYP19A1 的G等位基因（rs11638442,rs11632698）可能提升AD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[22]。有研究發(fā)現(xiàn)ABCG2 在人體腦內(nèi)皮組織高表達(dá)，提示其可能與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)[25]。有研究發(fā)現(xiàn)EAE小鼠的發(fā)育過程中，TLR9 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá)，且與EAE發(fā)展有關(guān)[26]。有研究發(fā)現(xiàn)，樹突狀細(xì)胞的DRD5 受刺激后可增強(qiáng)炎癥，加速EAE的進(jìn)展，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)EAE小鼠樹突狀細(xì)胞中的DRD5 缺乏可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有炎癥潛能的CD4+T細(xì)胞亞群的頻率降低[27]。綜上可知，金釵石斛可通過多靶點(diǎn)治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。此外，通過“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)和“靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)整合分析，為后期在各類型神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中，選取具有潛力的活性化合物及靶點(diǎn)進(jìn)行研究，可進(jìn)一步有效揭示其分子機(jī)制。

本研究基于在線分析系統(tǒng)DAVID進(jìn)行通路富集分析發(fā)現(xiàn)，核心靶點(diǎn)主要與3 個(gè)通路Sphingolipid signaling pathway、Cocaine addiction以及Serotonergic synapse有關(guān)。其中，可卡因通過阻斷多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并抑制多巴胺再攝取，從而導(dǎo)致突觸間隙中多巴胺持續(xù)作用于DRD1、DRD5 等相應(yīng)受體，誘發(fā)Cocaine addiction[28]，而核心靶點(diǎn)TLR9 激動(dòng)劑可拮抗可卡因成癮，并能阻止運(yùn)動(dòng)過度效應(yīng)[29]。核心靶點(diǎn)ABCG2 是重要的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可通過靶向腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Sphingolipid signaling pathway向P-糖蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，提高CNS藥物治療療效[30]。核心靶點(diǎn)MIF和IL-6 等細(xì)胞因子可透過受損的血腦屏障，影響多巴胺、五羥色胺和去甲腎上腺素等神經(jīng)遞質(zhì)的代謝，引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的炎性反應(yīng)[31?33]。

有研究報(bào)道AD患者存在Sphingolipid代謝異常，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)淀粉樣β沉積可能促使酸性鞘磷脂酶激活，提示Sphingolipid signaling pathway參與Sphingolipid代謝異?？赡蹵D的發(fā)病機(jī)制[34]。有研究發(fā)現(xiàn)Cocaine addiction患者出現(xiàn)包括注意力、學(xué)習(xí)、記憶等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能異常，提示Cocaine addiction通路可能參與了Cocaine引起的神經(jīng)毒性[35]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Cocaine反復(fù)使用會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)生理學(xué)和結(jié)構(gòu)的永久性改變，引起精神疾病[36]。有研究發(fā)現(xiàn)Serotonergic synapse通路的一些多功能調(diào)節(jié)劑具有神經(jīng)保護(hù)、抗炎等潛力，且一種對(duì)Serotonergic synapse和多巴胺受體具有高度親和力的血清素轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑-Lumateperone已經(jīng)在癡呆、雙相抑郁疾病上進(jìn)行臨床試驗(yàn)[37]。

綜上所述，本研究基于整合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，通過“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)、“靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)及KEGG通路富集分析等一系列整合網(wǎng)絡(luò)分析，從系統(tǒng)層面揭示金釵石斛治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機(jī)制。但由于網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)的局限性，仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)對(duì)其關(guān)鍵成分及靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，為后續(xù)深入研究金釵石斛治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機(jī)制提供參考。