劉舒 張也 韋思思 歐陽海梅 梁金群 陳暖 曾偉宏 江劍輝

(1.廣東省婦幼保健院 兒童遺傳代謝與內(nèi)分泌科，廣東 廣州 511442；2.廣東省婦幼保健院醫(yī)務(wù)科，廣東 廣州 511442)

智力發(fā)育障礙伴小腦共濟(jì)失調(diào)(intellectual developmental disorder with cerebellar ataxia)是一種常染色體顯性遺傳病，目前報道的文獻(xiàn)非常少，它是由于染色體15q22.2區(qū)域的RAR相關(guān)孤兒受體A(RAR related orphan receptor A,RORA)基因變異引起的生長發(fā)育障礙(OMIM#600825)[1]。RORA基因變異可以導(dǎo)致多種異常臨床表現(xiàn)，包括智力發(fā)育障礙伴小腦共濟(jì)失調(diào)、發(fā)育遲緩、行走能力延遲、語言發(fā)育遲緩、斜視、遠(yuǎn)視、癲癇發(fā)作、隱性脊柱裂、共濟(jì)失調(diào)、肌張力減低、運動延遲、眼球震顫、慢性便秘、邊緣性人格障礙、動眼運動異常、智力殘疾、腦橋小腦萎縮、胼胝體發(fā)育不良、眼瞼肌陣攣、小腦發(fā)育不全、全面發(fā)育遲緩、自閉癥行為、弱視、錐體功能障礙、震顫、腎積水等[1,2]。本病的智力發(fā)育障礙和步態(tài)失調(diào)呈進(jìn)行性發(fā)展，如果能夠早期確診，對患兒的臨床癥狀緩解和后期的康復(fù)結(jié)局起到非常重要的作用。目前RORA基因變異導(dǎo)致智力發(fā)育障礙伴小腦共濟(jì)失調(diào)的發(fā)病機(jī)制已基本明確，但因臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，導(dǎo)致診斷和鑒別診斷非常困難。本研究采用家系全外顯子測序發(fā)現(xiàn)了RORA基因新的致病位點，擴(kuò)展了該病的基因型與臨床表型譜。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 患兒男孩，2020年11月首次到廣東省婦幼保健院兒童遺傳代謝與內(nèi)分泌科門診就診，主訴為：出生后發(fā)現(xiàn)生長發(fā)育落后，以運動發(fā)育遲緩為著。首次就診時年齡為4歲3個月，臨床表現(xiàn)為行走不穩(wěn)，不能獨走，步態(tài)異常，易跌倒，語言表達(dá)差，無有意義發(fā)音，對外界刺激無反應(yīng)，手勢表達(dá)少。門診擬診“精神運動語言發(fā)育遲滯，共濟(jì)失調(diào)”收入本院兒科病房。入院后對患兒進(jìn)行相關(guān)檢查。患兒男孩，2016年9月出生，其母親產(chǎn)前檢查一切正常，G1P1，孕40周順產(chǎn)?；純撼錾w重3.0kg，出生時無窒息，Apgar評分10分，喂養(yǎng)正常。運動發(fā)育史：7個月開始爬，22個月會站立，25個月開始扶走，走路不穩(wěn)，搖搖晃晃，且經(jīng)常摔倒；語言發(fā)育史：無有意義發(fā)音，對外界刺激毫無反應(yīng)，手勢表達(dá)少。父母籍貫廣東廣州，非近親婚配；否認(rèn)家族遺傳病史；患兒有一弟弟，2018年2月出生，生長發(fā)育正常。目前患兒大小便不能自理，聽力正常，咽反射基本正常。眼科檢查：無視神經(jīng)萎縮跡象；神經(jīng)系統(tǒng)檢查：步態(tài)異常，行走不穩(wěn)，搖搖晃晃，易摔跤；共濟(jì)運動檢查：指鼻試驗(-)，跟膝脛試驗(-)，閉目直立試驗(+)。四肢肌力低下，膝反射(+)，腹壁反射(+)，雙側(cè)自發(fā)巴氏征(+)，頸無抵抗，布氏征(-)，克氏征(-)。

1.2 輔助檢查

1.2.1 常規(guī)檢查 患兒入院后除了進(jìn)行心肌酶譜、肝腎功能、電解質(zhì)、血常規(guī)等檢查外，還進(jìn)行血糖、血氨、銅藍(lán)蛋白、微量元素、血氣分析、鐵蛋白、血脂、甲狀腺功能等代謝相關(guān)檢查；同時進(jìn)行了顱腦的影像學(xué)檢查；以及遺傳代謝病血串聯(lián)質(zhì)譜和尿液氣相質(zhì)譜檢測。

1.2.2 全外顯子組基因檢測 本研究通過了本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查批準(zhǔn)，征得患兒父母的知情同意。抽取患兒靜脈血5ml，采用Blood DNA Kit V2 CW2553血液提取試劑盒提取血液DNA，運用第二代測序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)進(jìn)行分析。DNA全基因組文庫的制備：利用KAPA Library Preparation Kit (Illumina ? platforms): KR0453-v3.13取750ng DNA樣本進(jìn)行超聲波打斷，得到150～200 bp的DNA片段。將片段末端補(bǔ)平后用AMPure XP 純化磁珠純化，純化后的DNA片段兩端加A堿基(A-Tailing)并連接接頭，連接后產(chǎn)物進(jìn)行8個循環(huán)的PCR擴(kuò)增。DNA樣本捕獲：在Agilent SureSelectXT2 Target Enrich System反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)對真空濃縮DNA文庫樣本進(jìn)行雜交捕獲。雜交混合液在65℃環(huán)境下孵育24h。而后加入Dynabeads MyOne Streptavidin T1 (Invitrogen)。雜交捕獲后的產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，13循環(huán)。PCR產(chǎn)物采用Agencourt AMPure XP 純化磁珠進(jìn)行純化并用Qubit dsDNA HS Assay Kit進(jìn)行定量。高通量測序：取捕獲后的DNA樣本進(jìn)行Illumina novaseq高通量測序。測序數(shù)據(jù)經(jīng)Illumina Sequence Control Software(SCS)評估合格后，進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取和生物信息學(xué)分析。

1.2.3 測序數(shù)據(jù)分析及Sanger測序驗證 變異位點致病性評級及數(shù)據(jù)解讀規(guī)則參考美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)會(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)指南[3]及ClinGen序列變異解釋(sequence variant interpretation，SVI)專家組對指南標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用建議[4-6]，排除千人基因組、 ExAC、 gnomAD等數(shù)據(jù)庫中突變頻率大于1%的變異位點，去除非功能性變異位點(如同義突變、非編碼區(qū)突變等)，再經(jīng)過致病性預(yù)測(SIFT、Polyphen2、CADD等軟件)、臨床癥狀對照、相關(guān)疾病數(shù)據(jù)庫查詢與文獻(xiàn)參考等綜合考慮，找到候選基因變異位點進(jìn)行家系驗證。所用注釋數(shù)據(jù)庫為： Human Genome38 (hg38/GRCh38)、 RefSeq、 dbSNP、 1000 Genomes phase3、 ExAC、 gnomAD等數(shù)據(jù)庫，所用解讀數(shù)據(jù)庫包括DGV、 DECIPHER、 OMIM、 UCSC、 ClinVar、 HGMD及PubMed等數(shù)據(jù)庫。隨后根據(jù)WES中發(fā)現(xiàn)的變異分別設(shè)計引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增以進(jìn)行Sanger測序，驗證全外顯子組測序(whole exome sequencing，WES)的結(jié)果及遺傳模式。測序結(jié)果通過MutationSurveyor軟件進(jìn)行序列比對分析，并進(jìn)行家系驗證。

2 結(jié)果

2.1 臨床結(jié)果

2.1.1 常規(guī)檢查結(jié)果 患兒常規(guī)生化檢查和血液、尿液的串聯(lián)質(zhì)譜檢查顯示結(jié)果無明顯異常，排除常見氨基酸、有機(jī)酸和脂肪酸代謝異常相關(guān)遺傳代謝性疾病。

2.1.2 影像檢查結(jié)果 影像學(xué)檢查：顱腦MRI平掃顯示雙側(cè)腦室稍增寬，雙側(cè)小腦半球體積減小，腦溝加深、增寬，提示輕度腦積水和小腦萎縮(圖1)。

圖1 患兒顱腦MRI檢查

2.2 全外顯子組基因測序及Sanger驗證 測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)一個與患兒臨床表型高度相關(guān)的基因RORA：c.79C>T (p.R27*)(NM_002943.3)雜合截短變異位點。此變異位于RORA基因第1號外顯子區(qū)域，該變異使第 27位密碼子 CGA 轉(zhuǎn)變?yōu)門GA，導(dǎo)致精氨酸(R)轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止密碼子，即 p.R27*。50名家系外正常對照和父母DNA測序未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)變異，提示該變異可能為新生致病性變異(圖2B、2C)。

2.3 新變異的致病性分析RORA基因c.79C>T (p.R27*)(NM_002943.3)變異在兩種功能預(yù)測軟件中都提示有害(SIFT Score：0.001，MutationTaster Score：1)。

2.4 新變異蛋白的結(jié)構(gòu)域分析 新生變異c.79C>T位于RORA蛋白N末端，使該蛋白發(fā)生提前終止 (p.R27*)，導(dǎo)致RORA蛋白缺失522個氨基酸肽鏈(圖2A)。經(jīng)過生物信息學(xué)功能預(yù)測，RORA蛋白提前終止，極有可能影響該蛋白的生物學(xué)功能(圖2D、2E)。

圖2 患兒家庭RORA基因變異測序結(jié)果和生物信息學(xué)分析

3 討論

基因變異位點RORA：c.79C>T (p.R27*)(NM_002943.3)在一般人群數(shù)據(jù)庫gnomAD中未收錄，該變異尚未在HGMD數(shù)據(jù)庫收錄，為新發(fā)現(xiàn)的變異位點。該截短變異在兩種功能預(yù)測軟件中都提示有害，根據(jù)ACMG指南，該變異評級為疑似致病變異。根據(jù)患兒的臨床表現(xiàn)和基因分析結(jié)果，此患兒診斷為常染色體顯性智力發(fā)育障礙伴小腦共濟(jì)失調(diào)。RORA基因新生變異致病有報道稱表型特征為發(fā)育遲緩、行走能力延遲、語言發(fā)育遲緩、斜視、遠(yuǎn)視、癲癇發(fā)作、隱性脊柱裂、共濟(jì)失調(diào)、肌張力減低、運動延遲、眼球震顫、慢性便秘、邊緣性人格障礙、動眼運動異常、智力殘疾、腦橋小腦萎縮、胼胝體發(fā)育不良、眼瞼肌陣攣、小腦發(fā)育不全、全面發(fā)育遲緩、自閉癥行為、弱視、錐體功能障礙、震顫、腎積水[1,2]。本例患者變異與該病已經(jīng)報道過的表型有相似的特征；頭顱磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)顯示雙側(cè)小腦半球體積減小，腦溝增寬、加深，說明有小腦萎縮。本例患兒的原因可能與RORA基因變異使運動神經(jīng)元受損相關(guān)。盡管RORA基因變異已經(jīng)在一些神經(jīng)退行性疾病的動物模型中被描述過[7-9]，但是兒童患病報道非常少[1]，說明對于RORA基因?qū)е鲁Ｈ旧w顯性智力發(fā)育障礙伴小腦共濟(jì)失調(diào)的表型程度和致病機(jī)制的研究和認(rèn)識還非常缺乏。因此，我們這例患兒發(fā)病的確切機(jī)制需要進(jìn)一步的功能研究來闡明不同的RORA基因變異所帶來的臨床表現(xiàn)差異。

RORA基因位于15q22.2，全長約741kb，包含11個外顯子[10,11]。迄今為止，共發(fā)現(xiàn)18種變異，均為復(fù)雜重排。本研究的家系發(fā)現(xiàn)的c.79C>T (p.R27*)為新生截短變異，該變異使RORA蛋白發(fā)生提前終止(p.R27*)，導(dǎo)致RORA蛋白缺失522個氨基酸肽鏈。經(jīng)過生物信息學(xué)功能預(yù)測，RORA蛋白提前終止，極有可能影響該蛋白的生物學(xué)功能。該變異尚未見報道，也不是已知的多態(tài)性改變，很可能是一個新的致病性變異位點，但尚需進(jìn)行功能分析證實。

本研究首次在一常染色體顯性智力發(fā)育障礙伴小腦共濟(jì)失調(diào)患兒發(fā)現(xiàn)RORA基因c.79C>T (p.R27*)雜合變異，且該變異為新生變異。我們的研究明確了患兒發(fā)病的遺傳學(xué)病因，為患兒的精準(zhǔn)治療和后續(xù)該家庭的產(chǎn)前診斷和優(yōu)生優(yōu)育，打下了堅實的基礎(chǔ)。