張華燕，何援軍

(浙江衢化醫(yī)院，浙江 衢州 324004)

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以炎性細胞浸潤為特征，導致滑膜、關節(jié)軟骨及骨退變的一種慢性全身性自身免疫性疾病[1]，具有發(fā)病率高、病程長、難治愈、致殘率高的特點，10%的患者會在數(shù)年內喪失勞動力[2-3]。RA早期表現(xiàn)為關節(jié)游走性疼痛及功能障礙，晚期則表現(xiàn)為關節(jié)僵硬與畸形[4]。由于RA的病因與發(fā)病機制尚不明確，而抗生素類藥物在本病治療中效果有限，并存在一定不良反應，因此尋找更加安全有效的治療方法具有重要的價值。薯蕷皂苷元為穿山龍的根莖提取物，是穿山龍總皂苷的主要成分，具有舒筋活絡、祛風止痛的功效[5]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究顯示，薯蕷皂苷元能夠減輕炎性反應[6-9]。為探討薯蕷皂苷元對于RA關節(jié)腫脹的改善效果及作用機制，我們進行了動物實驗，現(xiàn)總結報告如下。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物6周齡SPF級雄性SD大鼠70只，體質量180～200 g，由上海南方模式生物科技股份有限公司提供，實驗動物生產許可號：SCXK(滬)2019-0002。在溫度23～25 ℃、濕度60%～65%環(huán)境中，晝夜12 h交替適應性飼養(yǎng)。實驗方案通過醫(yī)學動物實驗倫理委員會批準。

1.2 主要試劑薯蕷皂苷元(北京索萊寶科技有限公司，純度≥98%)，雞源性Ⅱ型膠原(Sigma-Aldrich公司)，Nod樣受體蛋白3(Nod-like receptor protein 3，NLRP3)炎性體通路激活劑尼日利亞菌素鈉鹽(西安樂森生物科技有限公司)，甲醇、氯仿(鄭州建祥化工產品有限公司)，兔抗鼠白細胞介素(interleukin，IL)-1β、NLRP3單克隆抗體、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(Abcam公司)，IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)檢測試劑盒(上海恒遠生物公司)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒(武漢賽培生物科技有限公司)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司)。

1.3 實驗儀器ST-360酶標儀(上?？迫A生物股份有限公司)，WMS-1030生物顯微鏡(上海豫光儀器有限公司)。

2 方 法

2.1 造模及分組從70只大鼠中隨機選取55只，按照李立萍等[10]的方法建立Ⅱ型膠原誘導的RA大鼠模型。具體方法如下：按照30 mg·kg-1腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，在右后足跖皮內注射100 μL Ⅱ 型膠原乳劑(雞源性Ⅱ型膠原溶于0.01 mol·L-1乙酸中，使終濃度為5 mg·mL-1，與等體積弗氏完全佐劑冰浴混合，充分乳化制成)；1周后，在右后肢注射100 μLⅡ型膠原乳劑加強免疫1次。剩余15只納入空白組，先給予等量0.01 mol·L-1乙酸，1周后仍給予等量0.01 mol·L-1乙酸。4周后，由2名實驗人員觀察大鼠的關節(jié)腫脹程度，依據(jù)文獻[11]進行關節(jié)炎指數(shù)評定：無關節(jié)炎為0分；個別足趾及足底腫脹為1分；大部分足趾及足底腫脹為2分；踝關節(jié)及以下腫脹為3分；腫脹累及踝關節(jié)以上，不能負重為4分。取2名實驗人員評定的平均值作為最終評定結果，評分≥2分判定為造模成功。

將造模成功的48只大鼠隨機分為模型組、薯蕷皂苷元組、激活劑組，每組16只。造模成功后2 d，薯蕷皂苷元組按100 mg·kg-1腹腔注射薯蕷皂苷元(薯蕷皂苷元溶于甲醇，用生理鹽水稀釋至甲醇體積分數(shù)為5%)，空白組、模型組及激活劑組注射等量含5%甲醇的生理鹽水。1 h后激活劑組按100 mg·kg-1腹腔注射尼日利亞菌素鈉鹽[尼日利亞菌素鈉鹽溶于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，用生理鹽水稀釋至DMSO體積分數(shù)為5%]，薯蕷皂苷元組、空白組、模型組注射等量含5% DMSO的生理鹽水。每天干預1次，共干預2周。

2.2 實驗指標測定干預2周后，先對各組大鼠進行關節(jié)炎指數(shù)評定，然后將各組大鼠麻醉后自腹腔靜脈取血5 mL，干燥管和抗凝管中各保存2.5 mL，以4000 r·min-1離心10 min(離心半徑8 cm)，分別從干燥管和抗凝管中提取上清液，即為血清和血漿，于-20 ℃保存，用于炎癥因子和氧化應激因子含量檢測。

采血后，在各組大鼠右后肢踝關節(jié)正中做縱切口，分離肌肉，繼續(xù)分離可見平滑光亮的滑膜組織，用手術刀分離關節(jié)囊的滑膜層和纖維層，取出滑膜層組織。一部分HE染色后進行滑膜組織病理學觀察，另一部分(-80℃保存)以Western Blot法檢測滑膜組織NLRP3炎性體信號通路相關蛋白含量。

2.2.1關節(jié)腫脹情況評定 采用關節(jié)炎指數(shù)[11]評定各組大鼠右后肢的腫脹情況。

2.2.2外周血炎癥因子含量測定 取-20 ℃保存的血清，室溫下解凍，用ELISA試劑盒測定IL-1β、IL-6、TNF-α含量。按照ELISA試劑盒說明書加樣，用全自動酶標儀測定450 nm處的吸光度(A值)，通過繪制標準曲線得出IL-1β、IL-6、TNF-α含量。

2.2.3外周血氧化應激因子含量測定 取保存在-20 ℃的血漿，室溫下解凍，分別測定其中MDA、SOD、GSH的含量，均按照對應試劑盒說明書加樣。以硫代巴比妥酸法測定并計算MDA含量，以嘌呤氧化酶法測定并計算SOD含量，以ELISA法測定并計算GSH含量。

2.2.4滑膜組織病理學觀察 用于組織病理學觀察的滑膜組織樣品，用10%甲醛固定36 h，經(jīng)流水沖洗、9%硝酸脫鈣、閉光過夜、梯度乙醇脫水(低濃度到高濃度)、二甲苯透明處理后，置于已溶化的石蠟中包埋、切片，切片厚度5 μm。將切片于熱水中燙平，貼于載玻片上，在45 ℃恒溫箱烘干。二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水(高濃度到低濃度)，蒸餾水浸泡片刻，蘇木精水溶液染色5 min，酸水及氨水中分色，各5 s。流水沖洗1 h后入蒸餾水片刻。在70%、90%乙醇中各脫水10 min。酒精伊紅染色液染色3 min，再經(jīng)無水乙醇脫水、二甲苯透明、樹膠封片后，在顯微鏡觀察。

2.2.5滑膜組織NLRP3炎性體信號通路相關蛋白含量測定 取-80 ℃保存的關節(jié)滑膜組織，液氮速凍研磨后加入蛋白提取裂解液，冰上裂解、離心后取上清液。加入SDS上樣緩沖液，95 ℃水浴使蛋白變性，進行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h；洗膜后加入1∶1000稀釋的IL-1β、Caspase-1及NLRP3一抗，4 ℃孵育過夜；洗膜后加入1∶4000辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL發(fā)光液顯影。采用Image J軟件分析圖像，以β-actin為內參，IL-1β、Caspase-1及NLRP3相對表達量用蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值表示。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法采用SPSS24.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。各組大鼠的關節(jié)炎指數(shù)、外周血炎癥因子含量、外周血氧化應激因子含量、滑膜組織NLRP3炎性體信號通路相關蛋白含量的組間總體比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較均采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結 果

3.1 關節(jié)腫脹情況評定結果各組大鼠的關節(jié)炎指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義。激活劑組和薯蕷皂苷元組的關節(jié)炎指數(shù)均低于模型組(P=0.001，P=0.000)，薯蕷皂苷元組的關節(jié)炎指數(shù)低于激活劑組(P=0.000)。見表1。

3.2 外周血炎癥因子含量測定結果各組大鼠的血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較，組間差異均有統(tǒng)計學意義。模型組、激活劑組及薯蕷皂苷元組的血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均高于空白組(IL-1β：P=0.001，P=0.000，P=0.002；IL-6：P=0.001，P=0.000，P=0.016；TNF-α：P=0.000，P=0.002，P=0.043)；激活劑組和薯蕷皂苷元組的血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均低于模型組(IL-1β：P=0.003，P=0.000；IL-6：P=0.002，P=0.000；TNF-α：P=0.031，P=0.001)；薯蕷皂苷元組的血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均低于激活劑組(P=0.021，P=0.002，P=0.046)。見表1。

3.3 外周血氧化應激因子含量測定結果各組大鼠的血漿MDA、SOD、GSH含量比較，組間差異均有統(tǒng)計學意義。模型組、激活劑組及薯蕷皂苷元組的血漿MDA含量均高于空白組(P=0.000，P=0.000，P=0.001)，血漿SOD、GSH含量均低于空白組(SOD：P=0.000，P=0.000，P=0.001；GSH：P=0.000，P=0.000，P=0.002)；激活劑組及薯蕷皂苷元組的血漿MDA含量均低于模型組(P=0.000，P=0.000)，血漿SOD、GSH含量均高于模型組(SOD：P=0.000，P=0.000；GSH：P=0.001，P=0.000)；激活劑組的血漿MDA含量高于薯蕷皂苷元組(P=0.007)，血漿SOD、GSH含量均低于薯蕷皂苷元組(P=0.002，P=0.003)。見表1。

表1 各組大鼠關節(jié)炎指數(shù)、外周血炎癥因子及氧化應激因子含量

3.4 滑膜組織病理學觀察結果空白組關節(jié)滑膜組織結構、形態(tài)正常；模型組關節(jié)滑膜組織有炎性細胞浸潤，滑膜細胞增生，血管擴張，形成血栓；激活劑組關節(jié)滑膜組織病理變化較模型組改善，但有輕微滑膜細胞增生；薯蕷皂苷元組關節(jié)滑膜組織病理變化明顯改善。見圖1。

圖1 各組大鼠膝關節(jié)滑膜組織HE染色圖片(×200)

3.5 滑膜組織NLRP3炎性體信號通路相關蛋白含量測定結果各組大鼠關節(jié)滑膜組織IL-1β、Caspase-1、NLRP3含量比較，組間差異均有統(tǒng)計學意義；模型組、激活劑組及薯蕷皂苷元組滑膜組織IL-1β、Caspase-1、NLRP3含量均高于空白組(IL-1β：P=0.000，P=0.001，P=0.042；Caspase-1：P=0.000，P=0.000，P=0.006；NLRP3：P=0.000，P=0.001，P=0.013)；激活劑組和薯蕷皂苷元組的IL-1β、Caspase-1、NLRP3含量均低于模型組(IL-1β：P=0.001，P=0.000；Caspase-1：P=0.006，P=0.000；NLRP3：P=0.007，P=0.000)；薯蕷皂苷元組的IL-1β、Caspase-1、NLRP3含量均低于激活劑組(P=0.007，P=0.018，P=0.046)。見表2、圖2。

圖2 各組大鼠滑膜組織IL-1β、Caspase-1、NLRP3含量Western Blot法檢測結果

4 討 論

RA的病因以及發(fā)病機制比較復雜，至今仍未完全明確，但一般認為是因某種未知的外來抗原作用于有易感基因的個體，機體對外來抗原出現(xiàn)免疫反應的同時，通過分子模擬或誘導自身免疫耐受的破壞而引起自身免疫反應[12-13]。目前治療RA的藥物主要有非甾體抗炎藥、慢作用抗風濕藥和免疫抑制劑，這類藥物雖能較好地控制臨床癥狀，但不能有效防止骨侵蝕[14-15]。近年來，中醫(yī)藥在治療RA方面已顯現(xiàn)出一定的優(yōu)勢，并受到了國內外學術界的青睞。

組別樣本量/只IL-1β1)含量(x±s)Caspase-12)含量(x±s)NLRP33)含量(x±s)空白組150.46±0.070.54±0.080.69±0.08模型組161.02±0.101.16±0.121.27±0.12激活劑組160.72±0.080.90±0.101.01±0.11薯蕷皂苷元組160.56±0.060.73±0.080.88±0.09F值31.02523.65828.754P值0.0000.0000.000

現(xiàn)代醫(yī)學研究證明，穿山龍的有效成分甾體皂苷能改善免疫功能，發(fā)揮調節(jié)免疫、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、止咳祛痰、降糖降尿酸等藥理作用[7,16]。Song等[17]的研究表明，穿山龍可能是通過抑制外周炎癥介質的產生而起到鎮(zhèn)痛作用。Ou-Yang等[18]認為，穿山龍能明顯抑制肉芽組織增生和炎癥早期的毛細血管滲出。魏志萍等[19]研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷元可通過抑制環(huán)氧合酶2的表達，抑制TNF-α誘導的關節(jié)炎大鼠成纖維樣滑膜細胞異常增殖。王文云等[20]研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷元可以通過促進M2型小膠質細胞極化，并抑制M1型小膠質細胞極化發(fā)揮抗炎作用。本研究中，與模型組相比，薯蕷皂苷元組大鼠關節(jié)炎指數(shù)降低，炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量降低，氧化應激因子MDA含量降低，氧化應激因子SOD、GSH含量升高，而且關節(jié)滑膜組織病變明顯改善，提示薯蕷皂苷元能調節(jié)RA模型大鼠的免疫反應，緩解關節(jié)腫脹。

NLRP3炎性體是一種存在于細胞質的蛋白復合物，能被多種內外因素所激活；活化其效應蛋白Caspase-1，可將無活性的促炎細胞因子IL-1β和IL-18的前體剪切加工成熟并釋放，參與機體抵抗病原體的免疫應答反應；一旦體內對NLRP3炎性體的調控失衡，可生成過量的IL-1β和IL-18，從而引發(fā)一系列炎癥性疾病[21-22]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制NLRP3炎性體通路，能夠抑制炎癥因子的表達，緩解機體內炎癥反應[23-24]。本研究中，薯蕷皂苷元組和激活劑組滑膜組織中IL-1β、Caspase-1、NLRP3含量均低于模型組，但激活劑組滑膜組織中IL-1β、Caspase-1、NLRP3含量高于薯蕷皂苷元組，提示薯蕷皂苷元可能通過下調IL-1β、Caspase-1、NLRP3的表達，抑制NLRP3炎性體通路發(fā)揮治療作用。

本研究結果提示，薯蕷皂苷元能有效緩解RA大鼠的關節(jié)腫脹，其作用機制可能是通過下調IL-1β、Caspase-1、NLRP3的表達，抑制NLRP3炎性體信號通路介導的炎性反應。