安玉,郝榮安,匡瑞霞,胡春楠,陳璐,王志國(guó)

(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院燒傷整形外科,山東 青島 266071;2 青島元美整形醫(yī)院)

肌成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性是決定病理性瘢痕發(fā)生和轉(zhuǎn)歸的重要機(jī)制[1]。誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞再分化為其他類型的細(xì)胞可能是治療病理性瘢痕的有效方法之一。機(jī)械張力是導(dǎo)致病理性瘢痕形成的重要因素[2]。創(chuàng)面愈合初期,高張力下的創(chuàng)面刺激成纖維細(xì)胞大量增殖聚集,成纖維細(xì)胞高表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA),分化為肌成纖維細(xì)胞來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)外的力學(xué)平衡[3]。而創(chuàng)面愈合后期,伴隨著創(chuàng)周張力的降低,肌成纖維細(xì)胞逐漸再分化、凋亡最終形成成熟瘢痕,或在持續(xù)高張力作用下持續(xù)異常增殖而形成病理性瘢痕[4]。機(jī)械張力參與了肌成纖維細(xì)胞形成與再分化的全部過(guò)程。在前期研究中,我們應(yīng)用力學(xué)技術(shù)成功誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞,構(gòu)建肌成纖維細(xì)胞力學(xué)模型,闡明了機(jī)械張力在瘢痕形成過(guò)程中的作用及其機(jī)制[4-7]。本文研究探討肌成纖維細(xì)胞在微張力作用下的轉(zhuǎn)歸情況,為研究病理性瘢痕的轉(zhuǎn)歸提供理論依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

多通道細(xì)胞應(yīng)力加載儀(BF-3001C;Flex-cell公司,美國(guó));6 孔彈性基底膜培養(yǎng)板(BF-3001C;Flex-cell公司,美國(guó));CO2培養(yǎng)箱(Panasonic公司,日本);倒置光學(xué)顯微鏡(Olympus公司,日本);酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Bio Tek公司,美國(guó));ABI ViiATM7 SYBR Green qPCR 儀(ABI公司,美國(guó));化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(ALPHA FCE 公司,美國(guó))。Eagle培養(yǎng)基(CORNING 公司,美國(guó))、FBS、含EDTA 的胰酶(Gibco公司,美國(guó));Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒(同仁化學(xué),日本);ELISA 試劑盒(R&D Systems公司,美國(guó));TRIzol試劑(Ambion 公司,美國(guó));反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒(大連寶生物工程有限公司);PCR 引物及其序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成;整合素β1、α-SMA 兔抗人單克隆抗體(Abcam 公司,英國(guó)),山羊抗兔二抗(Abgent公司,蘇州),PVDF 膜、ECL發(fā)光液(Millipore公司,美國(guó))。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

人體背部正常皮膚標(biāo)本3例均取自青島大學(xué)附屬醫(yī)院美容整形外科行色素痣切除術(shù)的病人,均為女性,年齡分別為26、36、41歲。本文研究通過(guò)青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有病人均簽署知情同意書(shū)。應(yīng)用組織塊法體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞,取第3～5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。調(diào)整細(xì)胞懸液密度至1×107/L,均勻地接種于6孔彈性基底膜培養(yǎng)板,每孔2 mL。于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞融合度達(dá)30%后,更換培養(yǎng)基。根據(jù)前期研究方法構(gòu)建肌成纖維細(xì)胞模型[4],設(shè)置加載機(jī)械張力參數(shù)為:拉伸幅度10%,加力頻率0.1 Hz,加力波形為正弦波,加載機(jī)械張力7 d。實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組。陰性對(duì)照組:正常皮膚成纖維細(xì)胞,加載2%幅度牽張力;陽(yáng)性對(duì)照組:肌成纖維細(xì)胞,加載10%幅度牽張力;實(shí)驗(yàn)組:肌成纖維細(xì)胞,加載2%幅度牽張力。各組加載牽張力時(shí)間為7 d,37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2飽和濕度條件下培養(yǎng),每隔2 d每孔補(bǔ)充含體積分?jǐn)?shù)0.10血清培養(yǎng)液0.5 mL。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 加力結(jié)束后,各組取3孔細(xì)胞,每孔加入CCK-8試劑200μL,輕搖培養(yǎng)板將試劑混勻后繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。分別取200μL細(xì)胞培養(yǎng)上清液,置于96孔板中,以不含細(xì)胞的培養(yǎng)基作為空白孔,用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)處吸光度值,以其表示細(xì)胞數(shù)量。

1.3.2SYBR Green qPCR 法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)整合素β1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、α-SMA 和Ⅰ型膠原的m RNA 表達(dá) 加力結(jié)束后,各組取3孔細(xì)胞,應(yīng)用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后,行SYBR Green qPCR 檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系20μL,內(nèi)含有:SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10μL,上下游引物各0.8μL,ROX Reference DyeⅡ0.4μL,滅菌蒸餾水6μL,c DNA 溶液2μL。應(yīng)用ABI Vii ATM7 SYBR Green qPCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),以95℃、30 s,95 ℃、5 s,60 ℃、30s重復(fù)45個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完成后,應(yīng)用ABI Vii ATM7軟件對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的熔解曲線進(jìn)行自動(dòng)定量分析。以GAPDH 作為內(nèi)參,各引物序列見(jiàn)表1。采用相對(duì)定量法2-ΔΔCt計(jì)算各目的基因的m RNA 含量。ΔΔCt=(Ct目的-Ct內(nèi)參)-(Ct對(duì)照-Ct內(nèi)參)。

表1 PCR 引物及其序列

1.3.3ELISA 法檢測(cè)TGF-β1、Ⅰ型膠原含量 收集各組培養(yǎng)板孔內(nèi)細(xì)胞上清液,按照TGF-β1、Ⅰ型膠原ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.4Western-Blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)整合素β1、α-SMA 蛋白表達(dá)量 加力結(jié)束后,各組取3孔細(xì)胞,將蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑按100∶1的比例制成混合溶液,裂解細(xì)胞30 min 后,提取總蛋白,用BCA 法測(cè)定蛋白濃度,測(cè)定后加入1/4樣品體積量的上樣緩沖液,95 ℃金屬浴5 min后室溫備用。調(diào)整電泳參數(shù)為:濃縮膠80 V、30 min,分離膠120 V、60 min。取出凝膠后濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜參數(shù)280 m A 140 min。整合素β1、α-SMA 一抗稀釋濃度為1∶5 000,內(nèi)參β-actin稀釋濃度為1∶1 500;二抗稀釋濃度為1∶10 000。加入一抗4℃孵育過(guò)夜,加入二抗室溫下孵育1 h后,涂ECL 發(fā)光液于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中顯影。應(yīng)用Image J圖像分析系統(tǒng)測(cè)定各種蛋白條帶的灰度值,以灰度值和條帶面積的乘積(Int Den)進(jìn)行蛋白半定量的分析。蛋白的相對(duì)表達(dá)量=實(shí)驗(yàn)組(IntDen 目的-IntDen 內(nèi)參)/對(duì)照組(Int Den目的-Int Den內(nèi)參)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS R23.0.0.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)量資料結(jié)果以表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖能力比較

各組細(xì)胞增殖能力相比較,陽(yáng)性對(duì)照組＞實(shí)驗(yàn)組＞陰性對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=67.75,P＜0.05),見(jiàn)表2。

2.2 各組整合素β1的m RNA 和蛋白表達(dá)水平比較

陽(yáng)性對(duì)照組整合素β1m RNA 和蛋白表達(dá)高于實(shí)驗(yàn)組(F=807.45、90.23,q=47.86、2.53,P＜0.05),實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 各組TGF-β1、α-SMA、Ⅰ型膠原m RNA 表達(dá)和蛋白表達(dá)的比較

各組TGF-β1、Ⅰ型膠原m RNA 和蛋白含量比較,陽(yáng)性對(duì)照組＞實(shí)驗(yàn)組＞陰性對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=132.63～981.60,P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組α-SMA m RNA 和蛋白表達(dá)高于陰性對(duì)照組,差異有顯著性(F=496.01、132.64,q=37.43、16.95,P＜0.05),實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組α-SMA 蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表2,圖1。

圖1 各組細(xì)胞整合素β1、α-SMA蛋白表達(dá)Westen-Blot結(jié)果

表2 各組細(xì)胞增殖能力和其他指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較(n=6,)

表2 各組細(xì)胞增殖能力和其他指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較(n=6,)

與陰性對(duì)照組比較,#q=2.39～62.95,P＜0.05;與陽(yáng)性對(duì)照組比較,*q=1.93～47.86,P＜0.05。

3 討 論

肌成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性是決定增生性瘢痕發(fā)生和轉(zhuǎn)歸的重要機(jī)制[1]。最近研究發(fā)現(xiàn),肌成纖維細(xì)胞能夠被誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞[8]。誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞再分化為其他類型細(xì)胞,可能是治療病理性瘢痕的有效手段之一。

機(jī)械張力是影響創(chuàng)面愈合和瘢痕形成的重要因素[9]。創(chuàng)面愈合早期,皮膚完整性遭到破壞,創(chuàng)面承受機(jī)械張力驟增,刺激炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、成纖維細(xì)胞大量增殖聚集[10];組織再生期,皮膚成纖維細(xì)胞在張力作用下表達(dá)α-SMA,分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)成分,分化為肌成纖維細(xì)胞,肌成纖維細(xì)胞籍α-SMA維持細(xì)胞內(nèi)外之間的力學(xué)平衡狀態(tài)[3,11];創(chuàng)面愈合后期,肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸決定了創(chuàng)面愈合的最終結(jié)果。研究表明,如果創(chuàng)面修復(fù)后不再承受較大的機(jī)械張力刺激,肌成纖維細(xì)胞逐漸再分化、凋亡,創(chuàng)面最終形成成熟的瘢痕[12];如果創(chuàng)面持續(xù)承受較大的機(jī)械張力刺激,肌成纖維細(xì)胞持續(xù)增殖,創(chuàng)面就會(huì)形成病理性瘢痕[3,13]。

創(chuàng)面愈合的不同結(jié)局提示機(jī)械張力參與了肌成纖維細(xì)胞形成與再分化的全部過(guò)程[14-15]。細(xì)胞對(duì)機(jī)械張力的反應(yīng)有一定選擇性,在比較適合的張力作用下才會(huì)產(chǎn)生明顯的力學(xué)-生化信號(hào)傳導(dǎo)。有研究表明,在牽張力幅度低于2%時(shí),真皮成纖維細(xì)胞不會(huì)發(fā)生形態(tài)學(xué)變化[16],本文陰性對(duì)照組結(jié)果與其一致。因此,我們推測(cè)低幅度牽張力可能會(huì)誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞再分化。

足夠大的張力微環(huán)境和TGF-β1是誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞形成的兩個(gè)必要條件[17-18]。整合素-細(xì)胞骨架信號(hào)通路是機(jī)械張力傳導(dǎo)的主要途徑[17-20]。整合素胞外區(qū)域與其特異的細(xì)胞外基質(zhì)配體結(jié)合后,就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞骨架蛋白聚集,形成黏著復(fù)合體,黏著復(fù)合體可以成熟為更大的黏著斑(FA)。只有形成足夠大的FA,成纖維細(xì)胞才開(kāi)始表達(dá)α-SMA[21]。整合素、FA、α-SMA 都是張力的傳導(dǎo)者,負(fù)責(zé)把力學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)至胞內(nèi)影響基因表達(dá)[22]。同時(shí),足夠大的機(jī)械張力才能通過(guò)整合素激活細(xì)胞外基質(zhì)中潛伏狀態(tài)的TGF-β1,活化的TGF-β1通過(guò)SMAD 信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞基因表達(dá)[23-24]。

肌成纖維細(xì)胞內(nèi)α-SMA、TGF-β1表達(dá)水平較高,而皮膚成纖維細(xì)胞表達(dá)少量的TGF-β,且?guī)缀醪槐磉_(dá)α-SMA[25]。機(jī)械張力使成纖維細(xì)胞大量分泌TGF-β1,TGF-β1可協(xié)同機(jī)械張力的作用促使細(xì)胞表達(dá)α-SMA、Ⅰ/Ⅲ型膠原,促使成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞[26-27]。與正常皮膚成纖維細(xì)胞相比,肌成纖維細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)能力較高,突出表現(xiàn)為α-SMA、TGF-β1、Ⅰ型膠原等重要分子標(biāo)志物的表達(dá)水平提高[28-29]。

基于前期研究結(jié)果,本文構(gòu)建肌成纖維細(xì)胞模型作為本次研究的目的細(xì)胞,選擇10%和2%幅度的牽張力作為高、低幅度牽張力作用于肌成纖維細(xì)胞,以正常成纖維細(xì)胞持續(xù)加載2%幅度的牽張力為陰性對(duì)照組。本文研究結(jié)果顯示,10%幅度的牽張力明顯刺激肌成纖維細(xì)胞增殖,2%幅度的牽張力作用下肌成纖維細(xì)胞的增殖能力高于正常成纖維細(xì)胞,再次證明張力對(duì)成纖維細(xì)胞具有促增殖的作用。同時(shí),在2%幅度牽張力作用下,肌成纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞內(nèi)整合素β1基因和蛋白表達(dá)水平明顯低于10%幅度牽張力作用下的水平,說(shuō)明細(xì)胞對(duì)較低幅度牽張力的傳導(dǎo)效應(yīng)較弱,與我們前期的研究結(jié)果一致。理論上講,低幅度牽張力作用下,細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)會(huì)降低,生化反應(yīng)隨之減弱。本文的研究結(jié)果顯示,2%幅度牽張力作用7 d后,肌成纖維細(xì)胞TGF-β1、Ⅰ型膠原的基因和蛋白表達(dá)水平低于10%幅度牽張力作用,仍然高于正常成纖維細(xì)胞表達(dá)水平;肌成纖維細(xì)胞內(nèi)α-SMA 表達(dá)水平仍然較高。這一結(jié)果說(shuō)明,低張力微環(huán)境下肌成纖維細(xì)胞沒(méi)有發(fā)生明顯變化,這與臨床上病理性瘢痕的轉(zhuǎn)歸現(xiàn)象不符。因?yàn)轶w外培養(yǎng)不能完全模擬體內(nèi)細(xì)胞所處的復(fù)雜環(huán)境,推測(cè)低幅度牽張力不能直接誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞的再分化,可能存在其他機(jī)制介導(dǎo)了張力誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞再分化的過(guò)程。

綜上所述,在2%幅度牽張力作用下,肌成纖維細(xì)胞仍然高表達(dá)α-SMA、TGF-β1和Ⅰ型膠原,肌成纖維細(xì)胞的表型沒(méi)有發(fā)生本質(zhì)變化。低幅度牽張力作用不能直接誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞再分化,與機(jī)體復(fù)雜內(nèi)環(huán)境有關(guān),也可能存在其他機(jī)制參與了張力誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞再分化的過(guò)程,仍需要深入研究。