閆慧,徐慶科,高洪瑞,潘洋,郝巖,李健

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科,山東 青島 266003)

黃曲霉毒素主要由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產(chǎn)生[1]。作為迄今為止人類所知的毒性最強(qiáng)的食品污染物之一,黃曲霉毒素B1(AFB1)進(jìn)入人體后,可誘導(dǎo)組織損傷[2]。AFB1誘導(dǎo)組織損傷的機(jī)制十分復(fù)雜,其中氧化應(yīng)激被認(rèn)為是其產(chǎn)生毒性的重要基礎(chǔ)[3]。氧化應(yīng)激是凋亡的重要調(diào)節(jié)信號(hào)[4]。凋亡又稱為程序性細(xì)胞死亡,是一種細(xì)胞自主性自身破壞的死亡形式,可引起細(xì)胞形態(tài)改變、DNA 斷裂和凋亡小體形成[5-6]。WANG 等[7]研究表明,AFB1 可誘導(dǎo)產(chǎn)生過量的活性氧(ROS),觸發(fā)氧化應(yīng)激并誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。因此,有必要找到安全有效的天然抗氧化劑,以預(yù)防或減輕AFB1誘導(dǎo)的心肌損傷。褪黑素(MT)是一種由松果體分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌激素,具有調(diào)節(jié)生物節(jié)律、抗氧化的作用[8-9]。MT 可以很容易地進(jìn)入細(xì)胞和亞細(xì)胞區(qū)室,從而在減輕氧化應(yīng)激方面優(yōu)于其他抗氧化劑[10]。近年來的研究表明,MT 對(duì)由氧化應(yīng)激水平升高誘發(fā)的多種心臟疾病均具有治療作用,如心肌缺血/再灌注性損傷、糖尿病性心肌病等[11-12]。但關(guān)于MT 干預(yù)黃曲霉毒素誘發(fā)的心肌損傷少見報(bào)道。因此,本研究構(gòu)建AFB1所致大鼠心肌損傷模型,并給予MT 干預(yù),探討MT 對(duì)AFB1心肌毒性的改善作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

成年雄性健康SD大鼠,體質(zhì)量約150 g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,許可證號(hào)為SCXK(魯)20140007。MT 為Sigma公司產(chǎn)品;AFB1購于上海誠竺生物科技有限公司;抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)抗體和抗β-action抗體均由美國Abcam 公司提供;超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)以及TUNEL試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶-MB(CK-MB)試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品;DAB染色液由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供;BCA 試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組及處理 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,將大鼠將隨機(jī)分為對(duì)照組(A 組)、AFB1 組(B 組)和AFB1+MT 組(C 組),每 組5 只。AFB1+MT 組大鼠給予MT 溶液(5 mg/kg,溶于乙醇生理鹽水中)每天1次灌胃,與此同時(shí)對(duì)照組和AFB1組大鼠給予等量的乙醇生理鹽水灌胃。MT 給藥后半小時(shí),AFB1組和AFB1+MT 組大鼠給予AFB1溶液(0.3 mg/kg)灌胃,對(duì)照組大鼠給予等量的含有二甲基亞砜的蒸餾水灌胃。連續(xù)灌胃6周。

1.2.2標(biāo)本采集 連續(xù)6周胃插管給藥后,腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉大鼠,腹主動(dòng)脈取血并迅速取出心臟組織。大鼠心臟被分為3等份,分別接受如下處理:①立即制備心臟組織勻漿液,檢測(cè)SOD、CAT 和MDA 的水平;②在液氮中速凍并保存于-80 ℃冰箱中待進(jìn)行蛋白質(zhì)提取和分析;③用40 g/L甲醛固定備分析細(xì)胞凋亡。

1.2.3血清LDH、CK-MB 水平的測(cè)定 從大鼠的腹主動(dòng)脈采集血樣,先在室溫下靜置30 min,再以3 000 r/min在4 ℃下離心10 min分離血清。根據(jù)試劑盒的說明,采用免疫抑制法測(cè)定血清CK-MB水平,采用微板法測(cè)定血清LDH 水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

1.2.4心臟組織MDA 含量和SOD、CAT 活性的測(cè)定 稱取新鮮大鼠心臟組織,制備100 g/L 勻漿液,在4 ℃下以12 000 r/min離心10 min。吸取上清液轉(zhuǎn)入新的EP管中,按照試劑盒說明書,利用各自的底物進(jìn)行酶促反應(yīng)并測(cè)量吸光度,計(jì)算心臟組織中MDA、SOD 和CAT 的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

1.2.5Western blot檢測(cè)caspase-3 的表達(dá) 將100 mg的冷凍大鼠心臟組織置于1 L 含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解緩沖液中充分裂解,在4 ℃下以12 000 r/min離心20 min,收集上清液,提取組織總蛋白,采用BCA 法測(cè)蛋白濃度。應(yīng)用125 g/L的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白(60 mg),轉(zhuǎn)膜,封閉,加入兔源一抗(caspase-3,1∶500;β-actin,1∶10 000),于4 ℃下孵育過夜,洗滌3次后在室溫下再加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)孵育2 h。最后用TBST 洗滌3次,通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)法使目標(biāo)條帶顯色,并使用Image J軟件分析其灰度值。目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平=目標(biāo)蛋白條帶的灰度值/β-action條帶的灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

1.2.6TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 每個(gè)樣本隨機(jī)取5張切片,用體積分?jǐn)?shù)0.03的過氧化氫封閉后,按試劑盒說明書對(duì)心臟石蠟切片進(jìn)行TUNEL 染色,以PBST 洗片,DAB 染色。在光鏡下觀察凋亡的心肌細(xì)胞(細(xì)胞核呈黃棕色者),應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0 軟件對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算凋亡率(凋亡細(xì)胞與每個(gè)區(qū)域中總細(xì)胞的百分比)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所得結(jié)果以表示,多組比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);兩個(gè)變量之間的相關(guān)性評(píng)估采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心臟損傷血清指標(biāo)的比較

各組大鼠血清CK-MB、LDH 水平存在明顯差異(F=16.60、17.75,P＜0.01)。與對(duì)照組相比,AFB1組大鼠血清中心肌損傷標(biāo)志物CK-MB 和LDH 的水平明顯升高(t=5.14、5.91,P＜0.01),而AFB1+MT 組大鼠的血清CK-MB、LDH 水 平較AFB1組顯著降低(t=3.06、3.61,P＜0.01)。見表1。

表1 各組大鼠心肌損傷血清指標(biāo)的比較(n=5,z/U·L-1,)

表1 各組大鼠心肌損傷血清指標(biāo)的比較(n=5,z/U·L-1,)

與A 組相比,*t=5.14、5.91,P＜0.01;與B組相比,#t=3.06、3.61,P＜0.01。

2.2 各組大鼠心臟組織MDA 含量及SOD、CAT活性的比較

與對(duì)照組相比較,AFB1組大鼠心臟組織勻漿液中MDA 含量顯著升高,抗氧化酶SOD 和CAT的活性顯著降低;與AFB1組相比,AFB1+MT 組大鼠MDA 含量明顯下降,SOD 和CAT 的活性明顯升高,組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.63～17.12,t=2.44～5.50,P＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠心肌氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較(n=5,)

表2 各組大鼠心肌氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較(n=5,)

2.3 各組大鼠心臟組織caspase-3蛋白表達(dá)比較

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,對(duì)照組、AFB1組和AFB1+MT 組心臟組織caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別為1.00±0.25、3.45±0.70、2.07±0.76。AFB1組大鼠心臟組織caspase-3蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組顯著增加(F=11.94,t=4.87,P＜0.01),AFB1+MT 組大鼠心臟組織caspase-3蛋白的表達(dá)顯著低于AFB1組(t=2.74,P＜0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠心臟組織caspase-3蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)

2.4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率的比較

TUNEL染色結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,AFB1組大鼠心肌細(xì)胞凋亡明顯增加(F=8.98,t=4.16,P＜0.01),但MT 預(yù)處理使心肌細(xì)胞的凋亡受到了抑制(t=2.29,P＜0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠心臟組織TUNEL染色

2.5 大鼠心臟組織中caspase-3與氧化應(yīng)激指標(biāo)的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析顯示,AFB1+MT 組大鼠心臟組織中caspase-3的表達(dá)水平與MDA 含量呈顯著正相關(guān)(r=0.857,P＜0.05),而與SOD 和CAT的酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.845、-0.732,P＜0.05)。

3 討 論

AFB1是已知最危險(xiǎn)的真菌毒素,攝入這種毒素能夠引起心臟損傷[13-14]。本研究采用AFB1溶液(0.3 mg·kg-1·d-1)灌胃構(gòu)建大鼠心肌損傷模型,顯示AFB1組大鼠血清中心肌損傷標(biāo)志物CK-MB和LDH 的水平明顯升高,說明大鼠心肌損傷模型制備成功;與AFB1 組相比,MT 給藥后AFB1+MT 組血清CK-MB、LDH 水平顯著降低。本研究結(jié)果首次證明,MT 的應(yīng)用可以有效地挽救暴露于AFB1所致的心肌損傷。為明確MT 對(duì)AFB1引起的大鼠心肌損傷的保護(hù)作用及機(jī)制,本研究進(jìn)一步檢測(cè)了各組大鼠的心臟氧化應(yīng)激指標(biāo)和心肌細(xì)胞凋亡程度。

相關(guān)研究表明,AFB1可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS,進(jìn)一步破壞膜質(zhì)和DNA 的結(jié)構(gòu),并抑制其修復(fù)而引起氧化應(yīng)激[15-16]。正常情況下機(jī)體的氧化和抗氧化能力處于平衡狀態(tài),任何增強(qiáng)氧化作用或降低抗氧化能力的因素均可打破這一平衡,致細(xì)胞內(nèi)ROS過量積累,進(jìn)而引起細(xì)胞氧化損傷[17-18]。其中,脂質(zhì)過氧化被認(rèn)為是氧化損傷的主要指標(biāo)之一,主要表現(xiàn)為MDA 含量的增加。MT 是目前已知的最為強(qiáng)效的抗氧化劑之一[19]。對(duì)大鼠肝臟的研究結(jié)果顯示,MT 可以顯著恢復(fù)谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、SOD 和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)等抗氧化酶的活性,有效減輕AFB1誘導(dǎo)的肝臟氧化損傷[20-21]。這些抗氧化酶共同參與機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的形成,其中,SOD 可催化氧自由基生成H2O2,進(jìn)一步在GPx和CAT 的催化下分解為水和氧[22-23]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)AFB1處理后,大鼠心臟組織勻漿液中MDA 的含量顯著升高,抗氧化酶SOD 和CAT的活性顯著降低,與以往的報(bào)道一致[13];AFB1+MT 組與AFB1組相比,MDA 含量明顯下降,組織抗氧化酶活性明顯升高,組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明MT 通過增強(qiáng)組織抗氧化能力來減輕AFB1誘導(dǎo)的心臟氧化損傷。

我們的前期研究證實(shí),AFB1引起的心臟損傷與心肌細(xì)胞的凋亡有關(guān)[24]。細(xì)胞凋亡過程需要多種半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的參與,其中,caspase-3是凋亡執(zhí)行過程中最主要的蛋白,并在AFB1暴露的心肌細(xì)胞中異常表達(dá),最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡[7,24]。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是凋亡的重要調(diào)節(jié)信號(hào)[25]。線粒體功能障礙與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡過程密切相關(guān),線粒體通透性的增加導(dǎo)致細(xì)胞色素C 的釋放增多,胞質(zhì)中游離的細(xì)胞色素C 可通過激活caspase-9而激活下游的caspase-3,最終導(dǎo)致凋亡的發(fā)生[26-28]。因此,氧化應(yīng)激的抑制可能對(duì)AFB1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。MEKI等[21]研究表明,MT通過改善氧化應(yīng)激,下調(diào)caspase-3蛋白的表達(dá),減輕AFB1誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡,從而保護(hù)肝臟組織免受AFB1的毒性損傷。目前,關(guān)于MT 對(duì)AFB1細(xì)胞毒性的保護(hù)作用的研究尚僅限于消化和生殖系統(tǒng)[29-30],而其與心臟有關(guān)的報(bào)道很少。

本研究TUNEL 染色顯示,AFB1可使大鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯增加,而給予MT 預(yù)處理則顯著抑制了AFB1 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡;Western blot檢測(cè)結(jié)果也顯示,MT 可以顯著降低AFB1誘導(dǎo)的caspase-3的活化,而caspase-3 是凋亡過程中的關(guān)鍵調(diào)控蛋白,說明MT 可能是通過下調(diào)caspase-3蛋白的表達(dá)來減輕AFB1的心肌毒性。進(jìn)一步的相關(guān)分析顯示,大鼠心臟組織中caspase-3的表達(dá)水平與MDA 含量呈正相關(guān),而與SOD 和CAT 的酶活性呈負(fù)相關(guān)。這些研究結(jié)果表明,MT 保護(hù)大鼠心臟免受AFB1的毒性損傷,其機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激、下調(diào)caspase-3的表達(dá),進(jìn)而減少心肌細(xì)胞的異常凋亡有關(guān)。

綜上所述,氧化應(yīng)激是AFB1心肌毒性的主要表現(xiàn)之一,最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡。作為人類可自身分泌的內(nèi)源性激素,MT 具有強(qiáng)大的抗氧化能力,且安全無毒性。本研究結(jié)果表明,MT 可以減輕AFB1誘導(dǎo)的心臟損傷,該作用可能是通過改善心肌抗氧化能力、抑制caspase-3蛋白的表達(dá)、降低心肌細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的,這為AFB1心臟毒性的治療提供了新的方法。