王玲,湯潛,張璐,劉世國,張小筱,劉雪梅

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院,山東 青島 266003 1 腎病科;2 產(chǎn)前診斷中心;3 醫(yī)學(xué)遺傳科)

子癇前期是一種常見的妊娠期疾病,是造成孕產(chǎn)婦死亡的主要原因之一,與圍產(chǎn)兒死亡率增加顯著相關(guān)[1]。子癇前期表現(xiàn)為妊娠20周后新出現(xiàn)高血壓和蛋白尿,但在母體癥狀出現(xiàn)之前便可出現(xiàn)全身內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[2]。目前子癇前期發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,研究認(rèn)為子癇前期發(fā)病與血管生成和抗血管生成失衡、免疫反應(yīng)、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和遺傳因素等密切相關(guān)[3-7]。研究發(fā)現(xiàn),來自母體和胎兒的多種遺傳因素在子癇前期發(fā)病中起著重要作用[8]。關(guān)于子癇前期家族史的一項(xiàng)調(diào)查研究表明,除了種族、區(qū)域和社會(huì)經(jīng)濟(jì)因素以外,遺傳因素導(dǎo)致了50%以上子癇前期的發(fā)生[9]。對歐洲血統(tǒng)人群進(jìn)行的一項(xiàng)全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)發(fā)現(xiàn),磷脂酶Cδ3(PLCD3)基因rs12946454位點(diǎn)與血壓增高有關(guān)[10]。但目前尚未有研究證實(shí)rs12946454位點(diǎn)多態(tài)性是否與妊娠期婦女高血壓疾病有聯(lián)系。本研究旨在探討PLCD3基因rs12946454 位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與山東漢族人群子癇前期易感性的關(guān)系,為子癇前期的診斷和篩查提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2017年3月—2019年6月期間,選取就診于青島大學(xué)附屬醫(yī)院、棗莊市婦幼保健院、聊城人民醫(yī)院、臨沂市人民醫(yī)院等子癇前期孕婦(子癇前期組)842例和年齡相匹配的足月分娩的正常妊娠婦女1 013例(對照組)作為研究對象。根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科學(xué)分會(huì)妊娠期高血壓疾病學(xué)組頒布的《妊娠期高血壓疾病診治指南(2015)》[11]制定子癇前期診斷標(biāo)準(zhǔn),并根據(jù)疾病嚴(yán)重程度將子癇前期病人分為輕度子癇前期組與重度子癇前期組,根據(jù)發(fā)病時(shí)間分為早發(fā)型子癇前期(妊娠34周之前發(fā)病)組與晚發(fā)型子癇前期(妊娠34周之后發(fā)病)組。子癇前期組納入標(biāo)準(zhǔn)為:①妊娠20周以后出現(xiàn)血壓≥18.7/12.0 kPa;②24 h尿蛋白≥300 mg或尿蛋白/肌酐比值≥0.3或隨機(jī)尿蛋白＞1+;③未發(fā)現(xiàn)蛋白尿但有其他器官或系統(tǒng)受累;④既往無原發(fā)性高血壓、腎功能異常、糖尿病和妊娠早期體質(zhì)量超標(biāo)(BMI＞25 kg/m2)等病史。對照組孕婦無子癇前期病史,無自身免疫性疾病,無妊娠期并發(fā)癥等病史。兩組孕婦均為漢族。采集兩組孕婦年齡、家族史、生育史、胎齡等人口統(tǒng)計(jì)學(xué)資料信息及相關(guān)臨床檢查結(jié)果。本研究得到了青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),并獲得研究對象知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1基因組DNA 提取 使用含EDTA 的真空采血管采集受試者外周靜脈血5 mL,置于-20 ℃冰箱保存。使用基因組DNA 提取試劑盒(北京天根)提取基因組DNA。

1.2.2PLCD3基因rs12946454 位點(diǎn)的基因分型采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)對PLCD3基因rs12946454 位點(diǎn)進(jìn)行基因型檢測。rs12946454位點(diǎn)上游引物序列為:5'-CACTCTCCACACTCACTCCTGCCCA-3';下游引物序列為:5'-GCCCTTTCTGGGGCTCCTGATGCCC-3'。所使用的Taqman探針由美國ABI公司設(shè)計(jì)合成。qPCR 反應(yīng)體系25.00μL,內(nèi)含:20×SNP探針1.25μL,2×PCR Master Mix 12.50μL,模板DNA 和去離子水共11.25μL。PCR 反應(yīng)條件為:95℃變性30 s,1個(gè)循環(huán);95℃、10 s,60℃、30 s延伸40個(gè)循環(huán);95℃、15 s,60℃、1 min,95℃、15 s,1個(gè)循環(huán)。使用Bio-Rad CFX manager 3.0軟件分析基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料結(jié)果以表示,兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn);應(yīng)用卡方檢驗(yàn)評估基因型頻率與Hardy-Weinberg平衡的一致性,皮爾森卡方檢驗(yàn)和Cochran-Armitage趨勢檢驗(yàn)比較各組基因型分布和等位基因頻率的差異。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

子癇前期組與對照組孕婦年齡、孕次及流產(chǎn)次數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。子癇前期組病人入院孕周、分娩孕周及新生兒體質(zhì)量均小于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-36.582～-26.956,P＜0.01)。見表1。

表1 兩組一般資料比較()

表1 兩組一般資料比較()

與對照組比較,*t=-36.582～-26.956,P＜0.01。

2.2 兩組PLCD3 基因rs12946454位點(diǎn)基因型分布與等位基因頻率比較

子癇前期組及對照組PLCD3基因rs12946454位點(diǎn)基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P＞0.05)。子癇前期組與對照組基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.066,P＞0.05),兩組等位基因頻率差異亦無顯著意義(χ2=2.066,P=0.558,OR=0.954,95%CI=0.814～1.118)。見表2。

2.3 輕度子癇前期與重度子癇前期病人PLCD3基因rs12946454位點(diǎn)基因型和等位基因頻率變化

與對照組相比,輕度子癇前期及重度子癇前期病人PLCD3基因rs12946454位點(diǎn)基因型分布差異均無顯著性(χ2=0.164、0.269,P＞0.05),等位基因頻率差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(輕度vs.對照:χ2=0.168,P=0.682,OR=0.934,95%CI=0.675～1.294;重度vs.對照:χ2=0.270,P=0.603,OR=0.957,95%CI=0.811～1.130)。輕度子癇前期和重度子癇前期病人相比,PLCD3基因rs12946454位點(diǎn)基因型分布及等位基因頻率差異無顯著性(基因型:χ2=0.021,P=0.884;等位基因:χ2=0.020,P=0.887,OR=0.976,95%CI=0.700～1.361)。見表2。

2.4 早發(fā)型與晚發(fā)型子癇前期病人PLCD3 基因rs12946454位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率比較

早發(fā)型子癇前期組、晚發(fā)型子癇前期組與對照組相比,PLCD3基因rs12946454位點(diǎn)基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.690、0.001,P＞0.05),等位基因頻率差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(早發(fā)組vs.對照組:χ2=0.693,P=0.405,OR=0.924,95%CI=0.768～1.113;晚發(fā)vs.對照:χ2=0.000,P=0.983,OR=0.998,95%CI=0.807～1.234)。早發(fā)型子癇前期與晚發(fā)型子癇前期組PLCD3基因12946454位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(基因型:χ2=0.416,P=0.519;等位基因:χ2=0.398,P=0.528,OR=0.926,95%CI=0.730～1.175)。見表2。

表2 兩組間PLCD3 基因rs12946454位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率的比較

3 討 論

研究表明,子癇前期發(fā)病涉及多種過程,包括異常的滋養(yǎng)層浸潤、血管痙攣、血小板活化、血管運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)因子失衡和胎盤缺血等[12]。雖然目前其發(fā)病機(jī)制還不完全清楚,但子癇前期只發(fā)生在妊娠期間或胎盤(滋養(yǎng)層)腫瘤存在的情況下,因而子癇前期是由胎盤因素觸發(fā)的[13]。在正常妊娠中,滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)入母體子宮螺旋動(dòng)脈,深入到螺旋動(dòng)脈甚至肌層水平,使得母體螺旋小動(dòng)脈廣泛重塑為高容量、高流量的血管,為胎兒提供營養(yǎng)[14]。在子癇前期胎盤中,滋養(yǎng)層細(xì)胞無法從增生的上皮細(xì)胞亞型轉(zhuǎn)變?yōu)榍忠u性內(nèi)皮細(xì)胞亞型,造成子宮螺旋動(dòng)脈的不完全重塑,導(dǎo)致母體血管狹窄,胎盤相對缺血[15-16]。病變胎盤促進(jìn)母體循環(huán)中可溶性有毒因子的釋放,從而導(dǎo)致炎癥、內(nèi)皮功能障礙和母體系統(tǒng)疾病[17]。研究顯示,包括轉(zhuǎn)錄因子、生長因子及受體和其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子在內(nèi)的多種基因參與胎盤發(fā)育[18]。

PLCD3基因位于第17號染色體的17q21.31,包含有16個(gè)外顯子,其中的rs12946454位點(diǎn)位于PLCD3基因的內(nèi)含子中[10]。研究表明,PLCD3參與促進(jìn)神經(jīng)元遷移和軸突突起延長[19],還在血管平滑肌信號傳導(dǎo)中起重要作用,可以被血管活性肽AngⅡ和內(nèi)皮素激活[20]。此外,還有研究發(fā)現(xiàn),同時(shí)敲除小鼠PLCD1基因和PLCD3基因可以造成小鼠滋養(yǎng)層缺陷而致妊娠中期胚胎死亡;PLCD1/PLCD3雙基因敲除小鼠胎盤迷路層結(jié)構(gòu)異常,胎盤血管減少[21]。因此,PLCD1和PLCD3基因在胎盤的正常發(fā)育中起著重要作用,PLCD3基因表達(dá)異?？赡軙?huì)造成胎盤發(fā)育不良,引發(fā)妊娠期疾病。

一項(xiàng)關(guān)于歐洲人群的GWAS 研究結(jié)果顯示,PLCD3基因rs12946454位點(diǎn)與高血壓有關(guān)[10],但該研究僅局限于歐洲人群及原發(fā)性高血壓疾病,目前尚未有相關(guān)研究證實(shí)PLCD3基因rs12946454位點(diǎn)遺傳多態(tài)性是否與妊娠期女性尤其是我國漢族婦女血壓升高有關(guān)。本研究對842例子癇前期孕婦和1 013例正常妊娠婦女進(jìn)行了檢測,結(jié)果顯示,與正常妊娠婦女相比較,子癇前期孕婦PLCD3基因rs12946454位點(diǎn)基因型分布及等位基因頻率差異無顯著性,表明PLCD3基因rs12946454位點(diǎn)多態(tài)性可能與子癇前期發(fā)病不相關(guān)。進(jìn)一步將子癇前期組分為輕度及重度子癇前期、早發(fā)型及晚發(fā)型子癇前期進(jìn)行研究,結(jié)果顯示,與正常對照組相比,輕度子癇前期及重度子癇前期PLCD3基因rs12946454位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率差異均無顯著性;早發(fā)型子癇前期及晚發(fā)型子癇前期基因型分布和等位基因頻率差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;輕度子癇前期和重度子癇前期相比、早發(fā)型子癇前期和晚發(fā)型子癇前期相比,PLCD3基因rs12946454位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率差異均無顯著性。提示PLCD3基因rs12946454位點(diǎn)遺傳多態(tài)性可能與山東漢族人群子癇前期發(fā)病不相關(guān)。

本次研究首次在山東漢族人群中檢測PLCD3基因rs12946454位點(diǎn)多態(tài)性與子癇前期發(fā)病的關(guān)系,結(jié)果未發(fā)現(xiàn)PLCD3基因rs12946454位點(diǎn)多態(tài)性與山東漢族人群子癇前期發(fā)病不相關(guān),與歐洲人群的GWAS結(jié)果不一致[10]。其原因可能與種族、地區(qū)及研究人群差異等因素有關(guān),也可能與妊娠期高血壓疾病自身特性有關(guān)系。還需要對不同地區(qū)、不同種族人群進(jìn)行更大樣本的相關(guān)遺傳研究,以闡明子癇前期與PLCD3基因多態(tài)性之間的關(guān)系。此外,目前尚缺乏PLCD3基因在高血壓相關(guān)疾病尤其是子癇前期中作用的研究報(bào)道,因此,深入研究PLCD3基因與子癇前期的關(guān)系,有利于完善子癇前期的發(fā)病機(jī)制,為子癇前期的治療和篩查提供理論依據(jù)。