林浩,王謙,趙桂秋

(青島大學附屬醫(yī)院眼科,山東 青島 266071)

煙曲霉菌是自然界中常見的致病微生物[1]。當人體外部屏障被破壞或免疫功能低下時煙曲霉菌極易致病[2]。煙曲霉菌導致的炎癥在充分抗真菌藥物治療后仍難以控制,原因在于其致病機制除了真菌侵襲對正常組織造成破壞之外[3],煙曲霉菌本身具備的抗原性也增加了組織的炎癥程度[4-5]。安石榴苷(PUN)是從石榴皮中提取的鞣花酸類物質(zhì),因其強大的抗炎作用被廣泛應用于中醫(yī)藥及化妝品中[6]。既往研究結果表明,PUN 在抗炎、抗氧化、抗癌、抗真菌、抗細菌等方面均發(fā)揮重要作用[7-11]。巨噬細胞是PUN 發(fā)揮抗炎作用的靶點[6]。已有研究證實,PUN 能夠通過PI3K/Akt/Nrf2/HO-1 通路減少活性氧(ROS)和一氧化氮的產(chǎn)生,增加超氧化物歧化酶1(SOD1)m RNA 的表達,從而抑制脂多糖誘導的巨噬細胞的氧化應激[7]。另有研究表明,PUN 能夠通過核因子κB(NF-κB)信號通路抑制腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素6(IL-6)基因表達,降低小膠質(zhì)細胞的炎癥反應[12]。本研究旨在探討PUN 對煙曲霉菌誘導炎癥的作用及其可能機制,以期為臨床治療煙曲霉菌感染所致的炎癥性疾病提供新思路。現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF 級C57BL/6雌鼠(8周齡),由江蘇省動物實驗中心提供,經(jīng)檢驗檢疫均合格,全身情況良好。實驗動物使用符合美國眼科和視覺研究協(xié)會(ARVO)關于動物使用的標準。

1.2 小鼠腹腔巨噬細胞的提取

小鼠腹腔注射體積分數(shù)0.03的硫代乙醇培養(yǎng)液1 mL,8 d后于無菌環(huán)境下收集腹腔積液細胞。向小鼠腹腔注射10 mL 高糖DMEM(Hyclone,美國),充分按摩后吸出,4 ℃下以12 000 r/min離心10 min,用含體積分數(shù)0.10 FBS(Hyclone,美國)的DMEM 重懸細胞,轉移至孔板。2 h后光鏡下觀察到細胞貼壁后更換培養(yǎng)液,進行預處理。

1.3 藥物細胞毒性測定

巨噬細胞在96孔板中貼壁后更換含有不同濃度PUN(Sigma,美國)的細胞培養(yǎng)液(體積分數(shù)0.10 FBS+DMEM)100μL,分別于24 和48 h 時加入CCK-8(MCE,美國)10μL,37 ℃孵育2 h后,用分光光度計(Eppendorf,德國)測量每孔450 nm 波長處光密度值。

1.4 滅活煙曲霉菌菌絲的制備

煙曲霉菌購自中國普通微生物培養(yǎng)物保藏中心。收集煙曲霉菌的孢子及菌絲,加入體積分數(shù)0.75的乙醇,混勻后置4 ℃冰箱過夜滅活菌絲。次日離心菌液,以無菌PBS(Solarbio,中國北京)洗滌3次,離心去上清液,加入DMEM 混勻,細胞計數(shù)板計數(shù)后調(diào)整菌絲終濃度為1×108/CFU。

1.5 實時熒光定量PCR(RT-PCR)方法檢測各指標mRNA 表達

用12孔板培養(yǎng)巨噬細胞,將細胞分為正常組(normal組,A 組)、加菌對照組(A.F.組,B 組)、加菌加不同濃度PUN 組(A.F.+25 mg/L PUN 組、A.F.+50 mg/L PUN 組、A.F.+100 mg/L PUN組,C、D、E 組)。滅活煙曲霉菌菌絲刺激8 h后,每孔加入500μL RNAisoPlus(大連寶生物工程有限公司),冰上裂解30 min后用細胞刮收集樣本至EP管,提取總RNA,按照Prime Script RTreagent Kit With gDNA Eraser(大連寶生物工程有限公司)試劑逆轉錄步驟,建立2μg 逆轉錄反應體系。使用β-actin為內(nèi)參照,應用RT-PCR 儀(Eppendorf公司,德國)進行PCR 擴增反應,分別檢測炎癥因子白細胞介素1β(IL-1β)、IL-6、白細胞介素10(IL-10)、TNF-α、巨噬細胞炎性蛋白2(MIP2)、趨化因子1(CXCL1)m RNA 表達以及誘導型一氧化氮合酶(i NOS)和Toll樣受體4(TLR4)m RNA 表達。引物序列于GenBank中查找,由TaKaRa寶生物工程有限公司負責引物的設計及合成。PCR 引物序列見表1。實驗重復3次。

表1 PCR 引物序列

1.6 蛋白印跡法(Western blotting)檢測IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達

滅活煙曲霉菌菌絲刺激16 h后,于6孔板中每孔加入100μL蛋白裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1),用細胞刮收集細胞蛋白于1.5 mL EP 管中,置冰上裂解2 h,4℃下以12 000 r/min離心5 min,取上清液,用BCA 蛋白濃度測定試劑盒(Solarbio,中國北京)測定蛋白濃度并計算上樣量。蛋白煮沸變性,行凝膠電泳,轉膜,封閉液(Solarbio,中國北京)封閉2 h。加一抗IL-1β(1∶500,美國RD)、IL-6(1∶500,中國Bioss)、TNF-α(1∶400,美國Cell Signaling Technology)、β-actin(1∶1 000,中國武漢Elabscience)、β-tubulin(1∶1 000,中國武漢Elabscience),4 ℃孵育過夜。以PBST 搖洗3 次,每次10 min,加二抗(1∶1 000,中國武漢Elabscience)室溫孵育2 h。以PBST 搖洗3次,每次10 min。用ECL(Byotime,中國北京)顯色,UVP凝膠成像系統(tǒng)(VILBER LOURM,美國)顯像,采用Image J軟件分析蛋白條帶。實驗重復5次。

1.7 DCFH-DA 檢測細胞內(nèi)ROS含量

巨噬細胞在96孔板中貼壁后更換培養(yǎng)液預處理2 h,加入滅活煙曲霉菌菌絲。在相應時間點加入DCFH-DA 探針(1∶1 000,美國MCE)37 ℃孵育20 min,PBS洗滌3次后使用熒光分光光度計,以488 nm 激發(fā)波長、525 nm 發(fā)射波長,實時檢測熒光強度。實驗重復3次。

1.8 統(tǒng)計學分析

應用Graph Pad 7.0 軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料數(shù)據(jù)以形式表示,組間比較用One-way ANOVA 檢驗,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PUN 對小鼠腹腔巨噬細胞的細胞毒性

巨噬細胞貼壁后分別加入含有0、25、50、100、200 mg/L PUN 的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng),在培養(yǎng)24、48 h時,各濃度組光密度值比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),提示25～200 mg/L PUN 在48 h內(nèi)對小鼠腹腔巨噬細胞無細胞毒性。見表2。

表2 不同濃度PUN 對腹腔巨噬細胞的細胞毒性(n=6,Dλ/OD,)

表2 不同濃度PUN 對腹腔巨噬細胞的細胞毒性(n=6,Dλ/OD,)

2.2 PUN 對腹腔巨噬細胞炎癥因子m RNA 表達的影響

滅活煙曲霉菌菌絲刺激8 h后,B 組細胞炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、MIP2及CXCL1m RNA 的表達水平較A 組顯著升高,PUN 可濃度依賴性降低上述炎癥因子m RNA 的表達水平,差異均有統(tǒng)計學意義(F=339.4～2 420.0,P＜0.01)。見表3。

表3 PUN 對相關細胞炎癥因子mRNA表達的影響(n=6,)

表3 PUN 對相關細胞炎癥因子mRNA表達的影響(n=6,)

2.3 PUN 對巨噬細胞炎癥因子蛋白表達的影響

滅活煙曲霉菌菌絲刺激16 h后,B組細胞炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白表達水平較A 組顯著升高,PUN 可濃度依賴性降低上述炎癥因子蛋白表達水平,差異均有統(tǒng)計學意義(F=71.7～501.3,P＜0.01)。見表4。

表4 PUN 對細胞炎癥因子蛋白表達的影響(n=6,)

表4 PUN 對細胞炎癥因子蛋白表達的影響(n=6,)

2.4 PUN 對巨噬細胞氧化應激水平的影響

巨噬細胞于96孔板中貼壁后,使用PUN 預處理,加入滅活煙曲霉菌菌絲刺激,分別于加菌后1、2、4、8、16、24 h 應用DCFH-DA 探針檢測細胞內(nèi)ROS水平。與加菌刺激前相比較,加菌后細胞內(nèi)ROS水平升高,于8 h時達峰,隨后降低。不同濃度PUN 組間比較,各時間點的細胞ROS水平差異均有統(tǒng)計學意義(F=439.5～739.8,P＜0.01)。見圖1。滅活煙曲霉菌菌絲刺激8 h后,RT-PCR 檢測結果顯示,隨PUN 濃度升高,i NOSm RNA 表達水平呈濃度依賴性降低,各組間差異均具有統(tǒng)計學意義(F=683.1,P＜0.01)。見表5。

圖1 PUN對巨噬細胞ROS水平的影響

2.5 PUN 對TLR4表達的影響

滅活煙曲霉菌菌絲刺激8 h后,B組細胞TLR4m RNA 表達水平較A 組顯著升高,PUN 可濃度依賴性降低TLR4m RNA 的表達水平,差異均有統(tǒng)計學意義(F=3 271.2,P＜0.01)。見表5。

表5 PUN 對細胞iNOS 及TLR4 mRNA 表達的影響(n=6,)

表5 PUN 對細胞iNOS 及TLR4 mRNA 表達的影響(n=6,)

3 討 論

PUN 提取自石榴皮,是一種水溶性鞣花酸類物質(zhì),具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗癌等多種作用。特別是其抗炎藥理作用,已在人體外腸道模型、豬離體皮膚等多種組織中被證實[13-15]。已有研究表明,巨噬細胞是PUN 在炎癥中作用的靶點,其在真菌性炎癥疾病的病程中發(fā)揮重要作用[16]。巨噬細胞能夠識別和內(nèi)化來自組織微環(huán)境的凋亡細胞和外來病原體,并且啟動炎癥和其他免疫細胞的活化[17],巨噬細胞產(chǎn)生的炎癥因子介導的直接損傷和免疫細胞的趨化募集是組織發(fā)生過度炎癥反應的重要原因。有研究顯示,PUN 可以下調(diào)脂多糖刺激后RAW264.7細胞系炎癥因子的表達[18-20],但PUN 對真菌刺激后巨噬細胞炎癥反應的影響尚未見研究報道。本實驗對此進行了探討。

本文RT-PCR 及Western blotting檢測結果顯示,經(jīng)PUN 預處理及真菌刺激后,隨PUN 濃度升高,巨噬細胞IL-1β等炎癥因子以及模式識別受體TLR4的表達水平呈濃度依賴性降低。且ROS檢測結果表明,高濃度的PUN 可以抑制滅活煙曲霉菌菌絲刺激后小鼠腹腔巨噬細胞的ROS水平。

大量研究結果表明,NF-κB 是真菌性角膜炎炎癥反應中重要的調(diào)節(jié)因子,它可以調(diào)節(jié)IL-1β等炎癥因子,通過這些細胞因子趨化炎癥細胞向病變部位浸潤[21]。KIM 等[22]的研究表明,PUN 可直接與神經(jīng)組織炎癥中的NF-κB亞基p50結合,下調(diào)其活性,進而影響NF-κB下游炎癥因子的產(chǎn)生。炎癥因子能夠直接導致組織損傷,擴大下游炎癥反應,并募集其他炎癥細胞,加重真菌性角膜炎的嚴重程度。XU 等[7]的研究證實,PUN 可以上調(diào)Nrf2 介導的通路并增強血加氧酶-1 表達,導致ROS 產(chǎn)生減少和一氧化氮產(chǎn)生過量。此外,PUN 也能夠降低人表皮角質(zhì)形成細胞、泡沫細胞、NIH3T3細胞等的氧化應激水平[23-25]。本實驗結果與以往研究結果一致,提示PUN 可對巨噬細胞中炎癥因子和ROS的表達產(chǎn)生影響。

綜上所述,PUN 能夠減輕煙曲霉菌誘導的小鼠腹腔巨噬細胞的炎癥反應,降低巨噬細胞氧化應激水平,并且PUN 預處理能夠降低細胞模式識別受體的表達,提示PUN 可能通過下調(diào)TLR4表達對巨噬細胞產(chǎn)生抗炎作用。但PUN 抗炎作用的具體機制還有待于進一步研究。