樊凱 陳移平 陳晶晶 王劍平 王維琴

最近幾年中，食源性致病菌的爆發(fā)已經(jīng)成為了公眾普遍關(guān)注的重要公共安全問題。在眾多的食源性致病菌中，大腸桿菌O157：H7尤為引起注意，主要是它能引起威脅生命的并發(fā)癥，如出血性結(jié)腸炎等。因此，開發(fā)相應(yīng)的可有效檢測大腸桿菌O157：H7的方法顯得尤為重要。

目前被用于檢測大腸桿菌O157：H7的檢測方法主要有細菌分離培養(yǎng)法、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）以及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）法等。這些方法各有各的不足，有的方法耗時長、靈敏度低、成本高，需要實驗室環(huán)境以及專業(yè)操作人員。最近，免疫傳感器（基于抗原抗體結(jié)合）在檢測大腸桿菌O157：H7中的作用顯得越來越重要。在眾多免疫傳感器中，阻抗免疫傳感器由于其免標記、快速以及可便攜化的優(yōu)勢，在檢測大腸桿菌O157：H7中的優(yōu)勢也非常明顯。而在免疫傳感器方面，依然需要新的電極材料來構(gòu)建高靈敏度、低成本以及小型化的阻抗免疫傳感器。

石墨烯是一種單層碳原子的蜂窩狀二維納米結(jié)構(gòu)，被認為是一種新型以及有效的電極材料。石墨烯材料的主要特性是有大的比表面積、優(yōu)異的生物相容性，最為重要的是它可以加速電解質(zhì)物質(zhì)和電極之間的電子傳遞。另外，金納米顆粒的獨特特性能夠為生物分子的固定提供合適的微環(huán)境，并加速生物分子與電極之間的電子傳遞。

在本研究中，我們開發(fā)了一種新型的阻抗生物傳感器用于大腸桿菌O157：H7的檢測，主要基于納米金修飾的石墨烯紙電極。通過抗體的固定，新型的阻抗生物傳感器對于大腸桿菌O157：H7的檢測表現(xiàn)出了良好的分析特性。

一、試驗部分

1.試劑及儀器。氧化石墨烯溶液（2mg/mL），購買自先鋒納米（南京）；抗壞血酸、氫碘酸，購買自阿拉丁試劑（上海）；大腸桿菌O157：H7、兔抗-大腸桿菌O157：H7、LB培養(yǎng)基、牛血清白蛋白，均購買自生工生物（上海）。EDC、NHS，購買自Sigma-Aldrich（美國）；電化學工作站，購買自辰華儀器（上海）。

2.納米金/石墨烯紙復合電極的制備。使用抗壞血酸（2mg/mL）初步還原氧化石墨烯溶液，使用50mm直徑和0.22μm孔徑的濾紙進行真空抽濾，加入氫碘酸進行二次還原，并氮氣吹干獲得還原的石墨烯紙電極，最終在電化學沉積下實現(xiàn)納米金的修飾。

3.免疫傳感器的制備?？贵w的固定主要使用EDC/NHS體系來進行修飾，然后把一系列的細菌溶液（9.2×10²-9.2×10⁷cfu mL-1）加入到溶液中，進行檢測。

二、結(jié)果與討論

1.免疫傳感器的分析性能。為了定量評估免疫傳感器的性能，主要是動態(tài)檢測范圍以及檢測限，主要記錄了9.2×10²-9.2×10⁷cfu mL-1細菌溶液的奈奎斯特圖。如圖1所示，阻抗譜的半圓直徑隨著大腸桿菌O157：H7濃度的增加而變大。并且，電子轉(zhuǎn)移阻抗（Ret）在9.2×10²-9.2×10⁷cfu mL-1的范圍內(nèi)表現(xiàn)出了良好的線性范圍。如圖1所示，將大腸桿菌O157：H7濃度的對數(shù)與傳感器阻抗擬合后的線性回歸方程為：Y（Ω）=355.24+106.43X（log cfu mL-1）（R2=0.995）。阻抗免疫傳感器的檢測限為4.6×10²cfu mL-1。

我們還對阻抗免疫傳感器針對大腸桿菌O157：H7的特異性進行評價。主要測試了其他類型的細菌，如大腸桿菌DH5α、金黃色葡萄球菌以及單核李斯特菌等。當濃度均為10⁷cfu mL-1時，其他細菌沒有對傳感器造成相應(yīng)的干擾，表明了該傳感器對于大腸桿菌O157：H7的特異性。此外，該免疫傳感器的主要性能依賴于捕捉抗體的活性。將免疫傳感器放置在4℃的冰箱中，每天檢測免疫傳感器的性能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫傳感器在一個月之后依然保持93.1%的性能。該免疫傳感器良好的特異性以及穩(wěn)定性很好地說明了還原石墨烯紙以及金納米顆粒良好的生物相容性，從而能夠很好地保持抗體及其他生物分子的生物活性。

2.實際樣本檢測。我們同樣研究了基于還原石墨烯紙阻抗免疫傳感器用于實際食品樣品中的大腸桿菌O157：H7檢測的可行性。我們選取兩種食物樣本，包括牛肉和黃瓜。我們同樣繪制了在牛肉和黃瓜中檢測大腸桿菌的濃度曲線，得到了在黃瓜和牛肉中，傳感器的檢測限分別為4.6×10³cfu mL-1和4.6×10⁴cfu mL-1。結(jié)果表明，該傳感器可以用于復雜食品樣本中的大腸桿菌O157：H7的檢測。

在本研究中，我們開發(fā)了一種簡單靈敏的阻抗免疫傳感器用于大腸桿菌O157：H7檢測。該紙免疫傳感器的優(yōu)勢在于靈敏度高、選擇性好，以及良好的重復性和穩(wěn)定性等，可用于大腸桿菌O157：H7的檢測中，值得大力推廣。