馮永莉，楊晨，零春甜，楊振東，汪建明*，鄭志強(qiáng)

（1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津300457；2.軍事科學(xué)院系統(tǒng)工程研究院軍需工程技術(shù)研究所，北京100100）

近年來(lái)，由于塑料包裝帶來(lái)的食品安全和環(huán)境污染問(wèn)題，生物可降解包裝材料受到極為廣泛的關(guān)注。智能食品包裝是在成膜基材的基礎(chǔ)上添加功能性物質(zhì)使膜具備一些活性功能（如抗氧化、抑菌），從而延長(zhǎng)食品保質(zhì)期，或?yàn)榱擞^察被包裝食品的新鮮程度，添加指示劑，利用食品在儲(chǔ)藏過(guò)程中產(chǎn)生一些物質(zhì)與試劑發(fā)生特定反應(yīng)引起指示劑顏色變化，從而反映食品信息的技術(shù)[1]。

羧甲基纖維素（carboxymethyl cellulose，CMC）因豐富、廉價(jià)、無(wú)臭無(wú)味并具有良好的成膜性常被用作基材之一制備食品包裝膜[2]。甘油是一種口感甘甜、透明、無(wú)臭的稠狀液體，有助于增強(qiáng)膜的柔韌性和延展性，因此可以作為增塑劑添加到成膜基材中。山梨酸鉀作為防腐劑能有效地抑制霉菌、酵母菌和好氧性細(xì)菌的活性，從而能夠有效地延長(zhǎng)食品的保存時(shí)間，并保持原有食品的風(fēng)味[3]。魏占鋒等[4]以CMC為成膜基底，甘油為增塑劑，將納米纖維素添加到CMC中共混制備了CMC增強(qiáng)膜，結(jié)果表明共混改性可使膜的力學(xué)性能和對(duì)水蒸氣的阻隔性能提高，并同時(shí)提高了膜的熱性能。

將天然色素作為指示劑指示食品新鮮度已成為研究熱點(diǎn)。桑葚花青素是一種水溶性的天然色素，對(duì)人體無(wú)害，其結(jié)構(gòu)中含有大量的鄰位酚羥基，易被氧化形成穩(wěn)定的醌類(lèi)結(jié)構(gòu)從而起到清除活性氧的作用[5]。此外，桑葚花青素中的2-苯基苯并吡喃陽(yáng)離子會(huì)隨pH值的改變顯示不同顏色[6]。蔣光陽(yáng)等[7]以馬鈴薯淀粉、羧甲基纖維素鈉為成膜基材，紫薯花青素作為指示劑制備指示膜，結(jié)果表明，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，指示膜由紅色變?yōu)樗{(lán)紫色，說(shuō)明魚(yú)肉開(kāi)始腐敗變質(zhì)。本文將桑葚花青素共混CMC，并添加甘油和山梨酸鉀制備指示膜，分別研究桑葚花青素對(duì)指示膜機(jī)械性能、阻濕性、阻光性和抗氧化性等相關(guān)性能方面的影響。并將其應(yīng)用于魚(yú)肉的新鮮度檢測(cè)中，以期為智能食品包裝膜的進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚、新鮮草魚(yú)：市售。羧甲基纖維素（carboxymethyl cellulose，CMC）：北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；甘油、山梨酸鉀、1，1-二苯基-2-苦基肼 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：北京 Solarbio 科技有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

傅里葉紅外光譜儀（NICOLET IS50）：德國(guó)Thermo Scientific公司；質(zhì)構(gòu)儀（TA-XT2i）：英國(guó) Stable Micro System公司；測(cè)色色差計(jì)（WSC-S）：上海精密科學(xué)儀器有限公司；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（SP-752）：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；掃描電子顯微鏡（SU1510）：日本 Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葚花青素的提取

將桑葚烘干至恒重后粉碎，用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液作為提取劑，按照料液比1∶10（g/mL）混合，水浴攪拌1 h，濾液在50℃避光旋蒸得到花青素濃縮液，凍干得桑葚花青素粉[8]。

1.3.2 共混膜的制備

將CMC溶于去離子水中，45℃下磁力攪拌1 h以充分溶解，再加入甘油和山梨酸鉀繼續(xù)攪拌1 h，冷卻至25℃后，分別加入0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%的桑葚花青素粉，攪拌20 min至完全溶解。靜置30 min脫氣，得成膜液。將每100 mL成膜液澆鑄在一個(gè)20 cm×20 cm的亞克力平板中流延成型，放于鼓風(fēng)干燥箱30℃～40℃下干燥2 h成膜，揭膜，將膜置于25℃的密閉容器（相對(duì)濕度55%～57%）中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 指示膜厚度及機(jī)械性能的測(cè)定

以精度為0.01 mm的厚度儀測(cè)定指示膜厚度，在膜樣品上隨機(jī)取5個(gè)點(diǎn)，計(jì)算平均值。

參照GB 1040.3—2006《塑料拉伸性能的測(cè)定第3部分：薄膜和薄片的試驗(yàn)條件》[9]的方法測(cè)定指示膜的機(jī)械性能。將膜裁剪成20 mm×50 mm的大小，采用TA-XT2i質(zhì)構(gòu)分析儀測(cè)定抗拉強(qiáng)度（tensile strength，TS）和斷裂伸長(zhǎng)率（elongation at break，EAB）。初始距離為40 mm，拉伸速率為0.6 mm/s，每個(gè)樣品做3次重復(fù)。

1.3.4 指示膜的水分含量和溶解度的測(cè)定

用失重法測(cè)定樣品膜的水分含量，取2 cm×2 cm大小的膜片稱(chēng)其質(zhì)量m1，在75℃的鼓風(fēng)干燥箱中干燥48 h，稱(chēng)量干燥后膜的質(zhì)量m2，計(jì)算水分含量，如式（1）。

取2 cm×2 cm大小的膜，在75℃的鼓風(fēng)干燥箱中干燥48 h后稱(chēng)重得m2，將干燥后的膜樣品完全浸泡在50 mL去離子水中24 h，除去水分在同條件下干燥48 h稱(chēng)量得 m3，計(jì)算溶解度，如式（2）。

1.3.5 指示膜水蒸氣透過(guò)系數(shù)（water vapor permeability，WVP）的測(cè)定

參考GB 1037—1988《塑料薄膜和片材透水蒸氣性試驗(yàn)方法（杯式法）》[10]。將指示膜包住含有無(wú)水氯化鈣的測(cè)試杯杯口，將稱(chēng)量后的測(cè)試杯放入裝有飽和氯化鈉溶液（25℃,相對(duì)濕度75%）的干燥器中，膜內(nèi)外兩側(cè)保持一定的蒸汽壓差，每隔1 d稱(chēng)量，直至質(zhì)量變化小于0.001 g，每個(gè)樣品做3次重復(fù)。按式（3）計(jì)算。DPPH自由基清除率按式（4）計(jì)算。

式中：L為指示膜的厚度，mm；Δm為t時(shí)間內(nèi)的質(zhì)量差，g；t為水分透過(guò)時(shí)間，d；S為指示膜的有效面積，m2；ΔP為指示膜兩側(cè)的水分蒸汽壓差，kPa。

1.3.6 指示膜透光率的測(cè)定

參照LIU等[11]的方法，將指示膜夾持于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)的樣品吸收池，使入射光束垂直通過(guò)指示膜，測(cè)定透光率。以不放指示膜時(shí)透光率為100%作為對(duì)照，每個(gè)樣品做3次重復(fù)。

1.3.7 指示膜微觀形態(tài)的觀察

指示膜的微觀形態(tài)采用SU1510掃描電子顯微鏡觀察，將膜樣品在液氮下淬段，從而得到膜樣品的截面，對(duì)其進(jìn)行噴金處理，在1 100倍的放大倍數(shù)下獲取圖像。

1.3.8 指示膜分子結(jié)構(gòu)的測(cè)定

將待測(cè)樣品烘干至恒重后固定于試樣臺(tái)上，利用NICOLET IS50傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行紅外吸收光譜測(cè)試。設(shè)定測(cè)試條件：譜圖掃描范圍600cm-1～4000cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)64次。

1.3.9 指示膜抗氧化活性的測(cè)定

指示膜的抗氧化能力按照KONG等[12]的方法并進(jìn)行適當(dāng)修改。稱(chēng)取20 mg樣品（指示膜）溶于2 mL甲醇溶液中（膜提液），取1 mL膜提液與4 mL DPPH溶液（1 mmol/L）混合。將混合物劇烈搖動(dòng)，然后在25℃下黑暗中放置30 min，在517 nm處測(cè)量吸光度。另取1 mL甲醇溶液與4 mL DPPH溶液混合做空白對(duì)照。

式中：A樣品為樣品的吸光度；A空白為空白對(duì)照的吸光度。

1.3.10 魚(yú)肉新鮮度的檢測(cè)

將新鮮草魚(yú)去掉頭尾、魚(yú)鱗、魚(yú)皮，魚(yú)肉取10 g備用，將指示膜裁剪成大小為10 cm×10 cm的正方形覆蓋在魚(yú)肉上放入培養(yǎng)皿中并放置在4℃冰箱中儲(chǔ)存。

將魚(yú)肉樣品打碎置于燒杯中，取100 mL煮沸殺菌并冷卻至25℃后的蒸餾水倒入燒杯，均質(zhì)后過(guò)濾，利用pH計(jì)讀取pH值[13]；參照Wongwichian等[14]的方法測(cè)定魚(yú)肉的硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）值，并測(cè)定膜的色差變化。

1.3.11 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0和Origin 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan進(jìn)行方差分析，p＜0.05為顯著性差異。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葚花青素溶液在不同酸堿性下的顏色變化

不同酸堿性條件下花青素溶液中主要結(jié)構(gòu)及顏色見(jiàn)表1。

表1 不同酸堿性條件下花青素的顏色Table 1 Colour of anthocyanins under different acid base conditions

桑葚花青素在不同酸堿性下呈現(xiàn)出不同的顏色。這是由于酸堿性變化會(huì)導(dǎo)致花青素中黃烊鹽離子、醌式堿、甲醇假堿以及查耳酮4種結(jié)構(gòu)之間的平衡遭到破壞[15]。強(qiáng)酸環(huán)境時(shí)，黃烊鹽離子起主要作用，所以溶液表現(xiàn)為黃烊鹽離子的紅色。隨著堿性上升，黃烊鹽離子逐漸轉(zhuǎn)化為無(wú)色的甲醇假堿，溶液紅色也隨之減弱。堿性繼續(xù)升高，藍(lán)色醌型堿逐漸成為主要結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致溶液隨之變?yōu)樗{(lán)色。最后由于環(huán)境中堿性過(guò)強(qiáng)，花青素不穩(wěn)定而被降解，溶液變?yōu)辄S色。

2.2 桑葚花青素添加量對(duì)指示膜機(jī)械性能的影響

食品運(yùn)輸過(guò)程中會(huì)受到壓力，所以包裝材料需要具有一定的機(jī)械強(qiáng)度?？估瓘?qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率是評(píng)價(jià)包裝膜機(jī)械性能的重要指標(biāo)。桑葚花青素對(duì)指示膜機(jī)械性能的影響見(jiàn)圖1。

圖1 桑葚花青素對(duì)指示膜機(jī)械性能的影響Fig.1 Effect of mulberry anthocyanins on mechanical properties of films

由圖1可知，相比CMC膜，指示膜的抗拉強(qiáng)度隨著桑葚花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而增大，而斷裂伸長(zhǎng)率隨著桑葚花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而減小。這是因?yàn)樯］鼗ㄇ嗨睾罅糠宇?lèi)化合物，其羥基基團(tuán)可與CMC分子形成氫鍵，有利于CMC鏈的規(guī)整排列，增強(qiáng)抗拉強(qiáng)度。與此同時(shí)，由于桑葚花青素填補(bǔ)了更多的空間縫隙，降低了水分與成膜基材的交聯(lián)，使得膜的斷裂伸長(zhǎng)率降低[16]。這與LIU等[17]關(guān)于紫薯花青素指示膜機(jī)械性能的研究結(jié)果相類(lèi)似。隨著桑葚花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，CMC分子的鏈間距減小，從而有利于在單位面積的膜中形成具有較高分子含量的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，得到更加致密的膜材料，這種良好的內(nèi)部結(jié)構(gòu)也有利于CMC膜強(qiáng)度增加。但這種致密結(jié)構(gòu)也抑制了CMC分子鏈的活動(dòng)，使指示膜的斷裂伸長(zhǎng)率有所下降。

2.3 桑葚花青素添加量對(duì)指示膜含水率及溶解度的影響

桑葚花青素對(duì)指示膜水分含量及水溶性的影響見(jiàn)表2。

表2 桑葚花青素對(duì)指示膜水分含量及溶解度的影響Table 2 Effect of mulberry anthocyanins on moisture content and solubility of film

由表2可知，桑葚花青素的添加對(duì)指示膜的水分含量無(wú)顯著影響。隨著桑葚花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷增加，指示膜的溶解度先從29.88%降低至26.81%后又上升，溶解度的降低可能是由于桑葚花青素與羧甲基纖維素分子中的親水基團(tuán)相結(jié)合，形成了分子間作用力，使得指示膜的溶解度下降。但由于花青素是親水性物質(zhì)，過(guò)量添加會(huì)導(dǎo)致指示膜吸水能力更強(qiáng)，從而造成溶解度再次升高。

2.4 桑葚花青素添加量對(duì)指示膜水蒸氣透過(guò)系數(shù)的影響

食品包裝材料的主要功能之一是減少食品的水分流失，所以應(yīng)盡可能使膜的水蒸氣透過(guò)系數(shù)降低。桑葚花青素對(duì)指示膜水蒸氣透過(guò)系數(shù)的影響見(jiàn)圖2。

圖2 桑葚花青素對(duì)指示膜水蒸氣透過(guò)系數(shù)的影響Fig.2 Effect of mulberry anthocyanins on WVP of films

由圖2可以看出，桑葚花青素的加入使膜的水蒸氣透過(guò)系數(shù)先降低后升高。桑葚花青素的加入使得膜的結(jié)構(gòu)更加緊密，桑葚花青素對(duì)水分子的強(qiáng)吸附作用使指示膜不易釋放水分子，水蒸氣通過(guò)膜孔隙需要更長(zhǎng)的有效路徑，從而降低了水蒸氣透過(guò)系數(shù)[18]。當(dāng)桑葚花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%時(shí)，指示膜的水蒸氣透過(guò)系數(shù)最低，為1.39×10-10g/（cm·s·Pa）。當(dāng)花青素含量超過(guò)0.3%后，花青素中含有的大量親水酚羥基基團(tuán)可使水分子更易于透過(guò)指示膜，使膜的水蒸氣透過(guò)系數(shù)增高。

2.5 桑葚花青素添加量對(duì)指示膜透光率的影響

光照，尤其是紫外光會(huì)對(duì)食品品質(zhì)造成一定的影響，因此，對(duì)紫外線有良好阻隔性的包裝膜對(duì)保護(hù)食品品質(zhì)具有重要意義[19]。桑葚花青素對(duì)指示膜透光率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 桑葚花青素對(duì)指示膜透光率的影響Fig.3 Effect of mulberry anthocyanins on transmittance of films

指示膜基本骨架主要由羧甲基纖維素分子構(gòu)成。由圖3可知，桑葚粉的加入明顯改變了指示膜的透光率。在波長(zhǎng)范圍200 nm～240 nm內(nèi)，添加桑葚粉的指示膜透光率均為零。而在波長(zhǎng)240 nm～400 nm所有膜的透光率均低于純的CMC膜。在紫外光范圍內(nèi)，桑葚粉的添加顯著提高了指示膜對(duì)紫外光的阻隔作用，這對(duì)于保護(hù)食品品質(zhì)十分重要。

2.6 指示膜的微觀結(jié)構(gòu)分析

對(duì)添加了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)桑葚花青素的指示膜進(jìn)行微觀形態(tài)分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 橫切面掃描電子顯微鏡圖Fig.4 Scanning electron micrograph of the cross-section

如圖4所示，純CMC膜的橫截面有明顯的凹凸不平和裂紋，可能是因?yàn)镃MC大分子之間的氫鍵作用使得分子之間發(fā)生了團(tuán)聚現(xiàn)象，CMC顆粒易纏結(jié)團(tuán)聚，不能均勻地分散，整體有聚攏趨勢(shì)。當(dāng)桑葚花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%時(shí)，指示膜的截面變厚，凹凸不平和裂紋現(xiàn)象減緩。當(dāng)桑葚花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%時(shí)，膜無(wú)凹凸不平現(xiàn)象，但仍有輕微的裂紋現(xiàn)象。當(dāng)桑葚花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.3%～0.5%時(shí)，膜的截面光滑，組分均一且致密，無(wú)凹凸不平和裂紋現(xiàn)象。這可能是因?yàn)樯］鼗ㄇ嗨刂械姆恿u基可與CMC中的羥基基團(tuán)形成分子間氫鍵，減少聚合物中的分子內(nèi)氫鍵和鏈狀分子的纏結(jié)[20]。結(jié)果表明，桑葚花青素與CMC基質(zhì)有著良好的相容性。

2.7 指示膜的分子結(jié)構(gòu)的分析

傅里葉紅外光譜可用于分析分子之間的相互作用。2種或2種以上物質(zhì)混合前后其紅外譜圖特征峰的改變，能反映出物質(zhì)的分子間作用力以及化學(xué)相互作用[21]。紅外光譜圖見(jiàn)圖5。

圖5 紅外光譜圖Fig.5 FTIR spectra

從圖5可以看出，指示膜在3 340 cm-1附近有出峰，這是-OH的伸縮振動(dòng)吸收峰[22]。在2 937 cm-1和2 888cm-1處有明顯的吸收振動(dòng)伸縮峰，這與有機(jī)化合物的特征結(jié)構(gòu)-CH2和-CH引起的吸收峰相符合[23]。1 642 cm-1處是芳香環(huán)骨架上C＝C鍵的振動(dòng)吸收峰[24]，這與桑葚花青素提取物中的芳香族化合物極其吻合。CMC和桑葚花青素中1 041、1 022 cm-1處為C-O的伸縮振動(dòng)吸收峰，指示膜中對(duì)應(yīng)的峰移至1 053 cm-1處，這是因?yàn)榉肿娱g的氫鍵相互作用使兩種大分子間發(fā)生了交聯(lián)作用，形成了很強(qiáng)的分子間作用力，擾亂了單一組分的正常狀態(tài)。從峰型上可以推斷，CMC與桑葚花青素這兩種化合物在化學(xué)結(jié)構(gòu)上十分相似，因此兩者有著良好的相容性[25]。

2.8 指示膜的抗氧化性分析

DPPH自由基清除能力可用作評(píng)定物質(zhì)的抗氧化能力[26]。桑葚花青素對(duì)指示膜抗氧化性的影響見(jiàn)表3。

由表3可以看出，未加入桑葚花青素的CMC膜抗氧化性很弱，其DPPH自由基清除率僅為（14.96±0.08）%。加入桑葚花青素后，指示膜的抗氧化性顯著增加（p＜0.05），其中，桑葚花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的指示膜的DPPH自由基清除率達(dá)到最高值（96.75±0.35）%。這是因?yàn)樯］鼗ㄇ嗨厥且活?lèi)多酚類(lèi)物質(zhì)，酚羥基形成苯氧基可以消除自由基從而起到抗氧化的作用[27]。

表3 桑葚花青素對(duì)指示膜抗氧化性的影響Table 3 Effect of mulberry anthocyanins on antioxidant activity of films

2.9 魚(yú)肉新鮮度的檢測(cè)

TBARS值是影響肉類(lèi)品質(zhì)的重要參數(shù)。作為脂肪的氧化產(chǎn)物，TBARS值能夠反映脂質(zhì)的氧化程度[28]。儲(chǔ)藏期間魚(yú)肉pH值、TBARS值以及指示膜△E的變化見(jiàn)圖6。

圖6 儲(chǔ)藏期間魚(yú)肉pH值、TBARS值以及指示膜△E的變化Fig.6 Changes in the pH value,TBARS value of fish and△E of the film during storage

如圖6所示，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，魚(yú)肉的pH值、TBARS值以及指示膜的△E均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。TBARS值在第8天時(shí)已達(dá)0.89 mg/kg，說(shuō)明在儲(chǔ)藏期間，脂質(zhì)逐漸氧化。pH值由最初的6.43升高到7.96，這是因?yàn)殡S著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，魚(yú)肉中脂肪和蛋白質(zhì)等物質(zhì)在微生物的作用下被分解為氨、三甲胺等堿性含氮物質(zhì)[29]。魚(yú)肉新鮮度隨著TBARS值以及pH值的上升而下降。并且隨著pH值不斷升高，指示膜的△E隨之升高，在第8天時(shí)達(dá)到24.89，顏色變化越來(lái)越明顯，這與2.1中桑葚花青素溶液顏色會(huì)隨著pH值的改變而改變的結(jié)論一致。因此，在魚(yú)肉的儲(chǔ)藏期間，可以直接通過(guò)肉眼觀察指示膜的顏色對(duì)魚(yú)肉的新鮮度進(jìn)行判別。

3 結(jié)論

利用桑葚花青素與羧甲基纖維素共混制備食品包裝膜，考察桑葚花青素對(duì)指示膜理化性質(zhì)及功能活性的影響。結(jié)果表明，桑葚花青素的添加對(duì)指示膜的理化性能產(chǎn)生了影響，膜的抗拉強(qiáng)度隨著桑葚花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增加，而斷裂伸長(zhǎng)率隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而略有減小。桑葚花青素的添加改善了膜的阻濕性和阻光性。隨著桑葚花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，截面結(jié)構(gòu)變得光滑均勻，表明桑葚花青素與CMC基質(zhì)有著良好的相容性。桑葚花青素與CMC之間的基團(tuán)發(fā)生了較強(qiáng)的相互作用并依靠分子間作用力影響膜的性質(zhì)，且桑葚花青素的加入未明顯改變?cè)系某煞?。DPPH自由基清除試驗(yàn)證明桑葚花青素增強(qiáng)了膜的抗氧化活性。將該指示膜用于魚(yú)肉包裝，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)，魚(yú)肉逐漸變質(zhì)，pH值、TBARS值不斷上升，指示膜顏色隨之變化，證明該膜可監(jiān)測(cè)魚(yú)肉儲(chǔ)藏過(guò)程中的新鮮程度。研究結(jié)果可進(jìn)一步拓展羧甲基纖維素膜的應(yīng)用領(lǐng)域。