劉慧純，王從平，劉群會(huì)，李文靜，賈 敏

腦卒中是目前嚴(yán)重威脅人類健康和生命的主要疾病之一，主要包括缺血性和出血性腦卒中兩種類型；在我國缺血性腦卒中占70%～80%[1-2]。缺血性腦卒中又名腦梗死，多見于老年人群，因具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高致殘率和高死亡率等特點(diǎn)而被重點(diǎn)關(guān)注[3]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死有明顯家族聚集傾向；此外，雙生子女發(fā)病一致和一級(jí)親屬發(fā)病率增高也提示腦梗死的發(fā)生與遺傳因素密切相關(guān)[4-5]。研究表明，抗血小板治療可明顯降低腦梗死等嚴(yán)重血管事件(如非致命性腦卒中、心肌梗死和血管源性死亡等)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，而在我國以氯吡格雷和阿司匹林抗血小板較為多見[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，與氯吡格雷單藥比較，氯吡格雷、阿司匹林聯(lián)合治療在減少急性腦梗死(ACI)病人缺血性事件方面并無明顯性優(yōu)勢(shì)，且可增加嚴(yán)重出血事件的發(fā)生率[7]。但有研究發(fā)現(xiàn)，部分病人在口服氯吡格雷治療或預(yù)防腦梗死時(shí)存在氯吡格雷抵抗[8]。究其原因發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)酶系統(tǒng)相關(guān)，Shuldiner等[9]通過參與氯吡格雷反應(yīng)的全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，CYP2C19基因多態(tài)性是氯吡格雷抗血小板聚集變異的主要決定因素，但其與腦梗死發(fā)生、療效及預(yù)后的關(guān)系尚不十分清楚。為此，本研究選取116例老年ACI病人和100名健康體檢者作為研究對(duì)象，探討CYP2C19基因多態(tài)性與老年ACI發(fā)生及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2017年1月—2019年1月恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院收治的116例老年ACI病人作為病例組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床表現(xiàn)及各輔助檢查符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)和中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)腦血管病學(xué)組聯(lián)合制定的《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》[10]；②首診，且發(fā)病至給藥時(shí)間<5 h；③年齡>60歲；④病人及家屬知情且簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①因煙霧病或動(dòng)脈炎引起的腦梗死；②合并腦腫瘤、腦血管畸形、腦出血或腦外傷者；③近半年存在重大外科手術(shù)者；④近期服用過氯吡格雷、華法林等影響血小板功能藥物者；⑤臨床資料或隨訪資料不完整者。116例老年ACI病人，其中男66例，女50例；年齡(73.17±8.95)歲；ACI亞型：大動(dòng)脈粥樣硬化型(LAA)50例，小動(dòng)脈閉塞型(SAO)60例，其他原因型(SUE)6例。選取同期100名健康體檢者作為對(duì)照組，其中男54名，女46名；年齡(74.22±9.31)歲。兩組性別和年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究獲得恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：2017L014)。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 病例組病人入院后立即給予吸氧、擴(kuò)血管、營養(yǎng)神經(jīng)、腦保護(hù)等常規(guī)治療，并給予氯吡格雷口服治療，其首次負(fù)荷劑量為300 mg，從第2天起以75 mg/d維持治療，連續(xù)治療7 d；此外還須針對(duì)高血壓、糖尿病等基礎(chǔ)疾病進(jìn)行對(duì)癥治療。病人在治療過程中禁止使用質(zhì)子泵抑制藥、阿司匹林、雙嘧達(dá)莫及溶栓藥等。

1.2.2 檢測(cè)方法 采用多聚合酶鏈反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)檢測(cè)各組CYP2C19基因多態(tài)性，具體為：①標(biāo)本收集，抽取病例組治療前和對(duì)照組空腹靜脈血3 mL于EDTA抗凝管中，并將其保存于-80 ℃冰箱中備用，待標(biāo)本集齊后一起檢測(cè)。②外周血基因DNA提取，用基因組DNA抽提試劑盒(購自北京天根生化科技有限公司)提取外周血中基因DNA，并用核酸定量分析儀測(cè)定其濃度和吸光度(A260/A280)比值，合格者(比值在1.7～2.0)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。③引物設(shè)計(jì)與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，參考美國Sequenom公司報(bào)道的CYP2C19基因序列(基因型包括G681A和G636A)，用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)CYP2C19基因引物，其中G681A位點(diǎn)正向、反向引物分別為5′-ACGTTGGATGGCAATAATTTTCCCACTATC-3′和5′-ACGTTGGATGACTTTCTCCAAAATATCC-3′；G636A位點(diǎn)正向、反向引物分別為5′-ACGTTGGATGAACATCAGGATTGTAAGCAC-3′和5′-ACGTTGGATGGACTGTAAGTGGTTTCTCAG-3′；PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系(25 μL)為DNA模板3 μL，其中正向、反向引物各0. 5 μL，Taq酶0. 25 μL，2倍預(yù)混合液10 μL和蒸餾水6 μL，反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(共循環(huán)35次)，72 ℃ 10 min。④電泳，用SmaⅠ和BamH I限制性內(nèi)切酶酶切擴(kuò)增產(chǎn)物后進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠成像分析儀下觀察結(jié)果，主要包括快代謝型(GG)、中間代謝型(AG)和慢代謝型(AA)。⑤測(cè)序，同時(shí)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海吉?jiǎng)P生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。本實(shí)驗(yàn)在專業(yè)技術(shù)人員指導(dǎo)下完成。

1.3 評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 參考相關(guān)文獻(xiàn)[11]制定氯吡格雷抵抗標(biāo)準(zhǔn)：血小板聚集抑制率<50%為氯吡格雷抵抗，血小板聚集抑制率≥50%為氯吡格雷不抵抗。隨訪6個(gè)月，采用改良Rankin量表(mRS)[12]評(píng)價(jià)病例組病人神經(jīng)功能恢復(fù)情況，mRS評(píng)分≥3分為預(yù)后不良，mRS評(píng)分≤2分為預(yù)后良好。

2 結(jié) 果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 經(jīng)卡方擬合優(yōu)度檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，病例組和對(duì)照組CYP2C19-G681A不同基因型和CYP2C19-G636A不同基因型的分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ2=3.657，P=0.161；χ2 =2.538，P=0.281)。詳見表1。

表1 病例組和對(duì)照組基因型分布 單位：例

2.2 CYP2C19基因多態(tài)性對(duì)ACI發(fā)生的影響 以ACI發(fā)生情況為因變量，將性別、年齡、CYP2C19-G681A和CYP2C19-G636A等位基因納入非條件Logistic回歸分析模型，發(fā)現(xiàn)CYP2C19-G681A和CYP2C19-G636A等位基因A均為ACI發(fā)病的影響因素(P<0.05)。詳見表2。

表2 CYP2C19基因多態(tài)性對(duì)ACI發(fā)生的影響

2.3 ACI不同亞型中CYP2C19-G681A和CYP2C19-G636A不同基因型分布 ACI不同亞型中CYP2C19-G681A和CYP2C19-G636A不同基因型比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 ACI不同亞型中CYP2C19-G681A和CYP2C19-G636A不同基因型分布 單位：例

2.4 抵抗組與不抵抗組CYP2C19-G681A和CYP2C19-G636A不同基因型分布 116例ACI病人中30例存在氯吡格雷抵抗(抵抗組)，86例不存在氯吡格雷抵抗(不抵抗組)。抵抗組與不抵抗組CYP2C19-G681A不同基因型和CYP2C19-G636A不同基因型比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表4。

表4 抵抗組與不抵抗組CYP2C19-G681A和CYP2C19-G636A不同基因型分布 單位：例

2.5 CYP2C19基因多態(tài)性對(duì)ACI預(yù)后的影響 隨訪6個(gè)月，116例ACI中預(yù)后良好者76例，預(yù)后不良者40例。以預(yù)后為因變量，將性別、年齡、ACI亞型、CYP2C19-G681A位點(diǎn)基因型、CYP2C19-G636A位點(diǎn)基因型、氯吡格雷抵抗情況納入非條件Logistic回歸分析模型，發(fā)現(xiàn)CYP2C19-G681A和CYP2C19-G636A基因AG型均為ACI預(yù)后不良的影響因素(P<0.05)。詳見表5。

表5 影響ACI預(yù)后的非條件Logistic回歸分析

3 討 論

目前從分子遺傳學(xué)水平解釋腦梗死的發(fā)病本質(zhì)和遺傳規(guī)律，以期為病人提供最佳診療方案，是國內(nèi)外腦血管疾病研究熱點(diǎn)[13]。CYP450家族是藥物代謝的主要酶系統(tǒng)，其存在遺傳多態(tài)性現(xiàn)象，由Wedlund等[14]在不同個(gè)體中S-美芬妥英代謝研究中首次發(fā)現(xiàn)并提出，后續(xù)研究指出，若編碼CYP450家族DNA序列發(fā)生變化可增加或降低，甚至消除酶的表達(dá)活性，嚴(yán)重影響其肝臟代謝，而CYP1、CYP2和CYP3家族則是參與人體內(nèi)外源化合物相關(guān)代謝[15]。隨著研究不斷深入發(fā)現(xiàn)，其中CYP2C19基因遺傳多態(tài)性具有最強(qiáng)種族間變異性[16]。CYP2C19基因位于人類染色體10q24.1-q24.3，有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，可編碼由490個(gè)氨基酸構(gòu)成的酶蛋白，目前已知的突變等位基因有25個(gè)，我國以CYP2C19-681 G/A(rs4244285)和CYP2C19-636G/A(rs4986893)最常見，以上兩種突變基因型均可造成 CYP2C19酶活性降低或喪失，氯吡格雷代謝功能受抑制，臨床表現(xiàn)為氯吡格雷抵抗[17-18]。 近年來，關(guān)于CYP2C19基因多態(tài)性的研究相對(duì)較多，但大多數(shù)集中在因CYP2C19基因多態(tài)性產(chǎn)生的氯吡格雷抵抗對(duì)疾病治療的影響，尤以腦梗死為主[19]。但關(guān)于其與腦梗死發(fā)生是否存在關(guān)系，對(duì)腦梗死預(yù)后是否有影響的研究相對(duì)較少。

本研究發(fā)現(xiàn)，病例組CYP2C19基因G681A位點(diǎn)和G636A位點(diǎn)的AA基因型和AG基因型比例均大于對(duì)照組，提示A等位基因可能與ACI發(fā)生相關(guān)；進(jìn)一步將性別、年齡等混雜因素及CYP2C19基因G681A位點(diǎn)和G636A位點(diǎn)各等位基因納入非條件Logistic回歸分析得知，CYP2C19-G681A和CYP2C19-G636A等位基因A均可增加ACI發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(P<0.05)，其OR值分別為 1.647和1.604，提醒臨床工作者除傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素外可增加老年病人CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)，對(duì)攜帶等位基因A病人做好提前干預(yù)，最大限度降低腦梗死發(fā)生率。ACI臨床類型不同，其療效及預(yù)后存在差異，那么CYP2C19基因多態(tài)性是否也影響ACI臨床分型?為此，本研究對(duì)比了ACI病人LAA型、SAO型和SUE型CYP2C19基因G681A位點(diǎn)和G636A位點(diǎn)各基因型分布，發(fā)現(xiàn)其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明ACI臨床分型與CYP2C19基因多態(tài)性無明顯關(guān)聯(lián)。本研究還比較了116例ACI病人中氯吡格雷抵抗者和不抵抗者CYP2C19基因G681A位點(diǎn)和G636A位點(diǎn)各基因型分布差異，發(fā)現(xiàn)抵抗者基因型以AA和AG為主。此外，本研究非條件Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，CYP2C19-G681A和CYP2C19-G636A基因型AG均為ACI預(yù)后不良的影響因素(P<0.05)，提示臨床工作者在ACI診療過程中尤其須要重視基因型為AG病人的個(gè)體化治療。

綜上所述，CYP2C19基因多態(tài)性與老年ACI發(fā)生及預(yù)后均相關(guān)，其中等位基因A和基因型AG分別可增加ACI發(fā)病及不良預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)。