王富強(qiáng)，張建，溫常龍，樊秀彩，張穎，孫磊，劉崇懷，姜建福

基于KASP標(biāo)記的葡萄品種鑒定

王富強(qiáng)1，張建2，溫常龍2，樊秀彩1，張穎1，孫磊1，劉崇懷1，姜建福1

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，鄭州 450009；2北京市農(nóng)林科學(xué)院北京蔬菜研究中心，北京 100097

【】開發(fā)一組能夠區(qū)分中國主栽葡萄品種的競爭性等位基因特異性PCR（KASP）分子標(biāo)記，為中國葡萄品種保護(hù)、品種登記和市場維權(quán)等提供技術(shù)支撐?；谇叭撕Y選的60個葡萄高多態(tài)性SNP位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化為KASP標(biāo)記。分別使用23份代表性品種和76份主要栽培品種對轉(zhuǎn)化成功的KASP標(biāo)記進(jìn)行初篩、復(fù)篩、驗(yàn)證，獲得一組高質(zhì)量的KASP標(biāo)記，并用于構(gòu)建76份葡萄品種的DNA指紋圖譜。60個SNP位點(diǎn)有3個不具備基因組特異性，6個無法設(shè)計KASP-PCR引物，最終51個SNP成功轉(zhuǎn)化為KASP標(biāo)記，轉(zhuǎn)化率達(dá)到89.47%。利用LGC-SNPline平臺對23份代表性品種進(jìn)行基因分型，51個KASP標(biāo)記全部成功分型?；诖我任换蝾l率（MAF）大于0.25、多態(tài)性信息含量（PIC）大于0.35、缺失率小于0.2、雜合率小于0.6等參數(shù)，初步篩選出27個優(yōu)質(zhì)KASP標(biāo)記。使用構(gòu)建指紋圖譜的76份品種復(fù)篩出22個高質(zhì)量KASP標(biāo)記。22個KASP標(biāo)記的缺失率均小于0.12，PIC均大于0.3，雜合率在0.4—0.6的標(biāo)記占77.27%，MAF大于0.3的標(biāo)記占95.45%。此外，利用這22個標(biāo)記對同一品種不同樹體提取的23份代表性品種的DNA擴(kuò)增檢測，前后兩次檢測分型結(jié)果穩(wěn)定一致，表明這22個標(biāo)記具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。進(jìn)一步將基于22個標(biāo)記獲得的76份葡萄品種分型結(jié)果轉(zhuǎn)化為二元編碼數(shù)據(jù)，得到76份葡萄品種的指紋圖譜。經(jīng)鄰接聚類分析和群體結(jié)果分析，可將76份葡萄品種分為3類，并能正確區(qū)分二倍體和多倍體。僅用10個標(biāo)記（VIT_15_18567587、VIT_6_4258638、VIT_8_3320936、VIT_12_22228357、VIT_11_19390306、VIT_16_17950801、VIT_18_11138668、VIT_12_739916、VIT_16_13454358、VIT_16_21202286）就能區(qū)分70份品種，其中有54份品種達(dá)到品種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)（差異位點(diǎn)數(shù)≥2）。從60個葡萄SNP中成功轉(zhuǎn)化51個KASP標(biāo)記，并篩選出22個高質(zhì)量KASP標(biāo)記，構(gòu)建了76份葡萄品種的SNP指紋圖譜，首次驗(yàn)證了KASP技術(shù)在我國葡萄品種鑒定中的可行性。

葡萄；KASP標(biāo)記；品種鑒定；指紋圖譜；遺傳多樣性分析

0 引言

【研究意義】葡萄為葡萄科（Vitaceae）葡萄屬（L.）多年生藤本植物[1]，全世界至少有23 000個品種（http://www.vivc.de/），其適應(yīng)性強(qiáng)，適栽范圍廣。不同地區(qū)間葡萄品種交流頻繁，而部分引種或地方品種又沒有確切的科學(xué)名稱，難免發(fā)生同物異名或同名異物現(xiàn)象[2]。另外，當(dāng)前葡萄苗木市場管理暫不完善，隨意更改品種名稱、炒作品種等不良現(xiàn)象時有發(fā)生，極大損害了育種家的利益，不利于葡萄產(chǎn)業(yè)的健康、可持續(xù)發(fā)展。因此，尋找一種經(jīng)濟(jì)、高效、準(zhǔn)確的品種鑒別方法，對于提高我國葡萄種質(zhì)資源管理效率和品種保護(hù)能力均具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】DNA分子標(biāo)記具有周期短、受環(huán)境影響小、可實(shí)現(xiàn)高通量檢測等優(yōu)點(diǎn)，為葡萄品種鑒定提供了新的手段。其中SSR（simple sequence repeat）和SNP（single nucleotide polymorphism）分子標(biāo)記已被國際植物新品種權(quán)保護(hù)聯(lián)盟（UPOV）BMT分子測試指南[3]和國內(nèi)《植物品種鑒定DNA指紋方法總則》（NY/T 2594-2016）[4]定為優(yōu)先推薦的兩種標(biāo)記方法。目前，國內(nèi)已研發(fā)出一套用于中國葡萄品種鑒定的30個SSR標(biāo)記體系[5]，并利用其中8個引物區(qū)分國內(nèi)290份葡萄品種[6]。但因SSR標(biāo)記數(shù)量和檢測通量有限、檢測成本偏高、數(shù)據(jù)讀取費(fèi)時耗力等因素[7]，限制了更大范圍的葡萄品種鑒定工作。SNP分子標(biāo)記作為最新一代標(biāo)記，具有數(shù)量多、具二態(tài)性、穩(wěn)定遺傳等優(yōu)點(diǎn)[8]，加上各種SNP高通量檢測平臺的出現(xiàn)，可以很好彌補(bǔ)SSR標(biāo)記的技術(shù)缺陷[9]，已在生物學(xué)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)和生物進(jìn)化等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[10]。其中，高通量SNP檢測技術(shù)主要有基因芯片和LGC公司推出的KASP（kompetitive allele specific PCR）技術(shù)，適用于不同檢測需求[9]?；蛐酒夹g(shù)主要適用于少樣本多位點(diǎn)檢測，如我國自主研發(fā)的Wheat 660K[11]、Rice SNP50[12]、Maize 50K[13]基因芯片，單次位點(diǎn)檢測量達(dá)上萬個，不足之處是當(dāng)前使用成本偏高，開發(fā)難度較大；KASP技術(shù)則適于多樣本、少位點(diǎn)的檢測，具有高效、靈活、準(zhǔn)確、低成本的特點(diǎn)[14]，國內(nèi)外研究者已利用KASP技術(shù)分別構(gòu)建小麥[15-16]、玉米[17]、水稻[10]、棉花[18]、甘藍(lán)[19]、黃瓜[20]等作物的核心標(biāo)記體系，為相應(yīng)作物的品種鑒定和品種保護(hù)等提供了便利。而SNP標(biāo)記在葡萄品種鑒定中，主要使用成本較高的基因芯片和測序技術(shù)，如Cabezas等[21]已構(gòu)建了針對歐亞種葡萄的SNP鑒定體系，并確定了48個SNP為鑒定品種的標(biāo)準(zhǔn)位點(diǎn)；LAUCOU等[22]基于18K SNPs葡萄基因芯片從945份材料中篩選出14個高多態(tài)性SNP標(biāo)記用于歐洲地區(qū)栽培品種鑒定?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前國際上篩選出的SNP標(biāo)記僅在二倍體歐亞種中得到應(yīng)用，而我國主栽的葡萄多為多倍體品種，因此有必要開發(fā)適用范圍更廣的SNP標(biāo)記。雖然李貝貝等[23]和LIANG等[24]利用不同重測序技術(shù)獲得上萬個SNP位點(diǎn)，分別對304份和472份葡萄種質(zhì)進(jìn)行了遺傳多樣性分析，但沒有篩選出用最少的SNP位點(diǎn)組合來鑒別葡萄品種的具體結(jié)果。在實(shí)際的葡萄品種鑒定工作中，研究者希望用最少的位點(diǎn)區(qū)分更多的樣本，以達(dá)到高效、準(zhǔn)確、廉價的鑒定目的，比較而言，KASP技術(shù)更適合SNP分子標(biāo)記開發(fā)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究基于前人開發(fā)的葡萄SNP標(biāo)記，以國內(nèi)主栽葡萄品種、新育成品種為試材，首次嘗試?yán)肒ASP技術(shù)篩選出一套能夠鑒別中國主栽葡萄品種的核心KASP標(biāo)記，并構(gòu)建葡萄品種SNP指紋圖譜，為我國葡萄新品種保護(hù)、市場維權(quán)等提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料于2020年6月采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所國家果樹種質(zhì)鄭州葡萄圃。

KASP標(biāo)記初篩：使用23份葡萄代表性品種，其具備不同倍性、不同種性、不同用途等特點(diǎn)，如二倍體歐亞種釀酒品種‘赤霞珠’‘黑比諾’，二倍體歐美雜種鮮食品種‘陽光玫瑰’‘金手指’，三倍體歐美雜種鮮食品種‘夏黑’，四倍體歐美雜種鮮食品種‘巨峰’‘巨玫瑰’等（表1）。KASP標(biāo)記復(fù)篩：使用76份葡萄品種，其中13份國內(nèi)主栽品種、63份近年新育成品種（表2）。

表1 KASP標(biāo)記初篩使用的23份葡萄代表品種信息

表2 KASP標(biāo)記復(fù)篩使用的76份葡萄品種信息

續(xù)表2 Continued table 2

1.2 DNA提取與檢測

使用愛森生物科技有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒，提取葡萄葉片DNA，采用NanoDrop 1000 spectrophotometer（Themo Scientific）紫外分光光度計檢測DNA濃度和純度（OD260/OD280=1.7—2.0），并用超純水將濃度稀釋至50 ng·μL-1，按編號裝入96孔PCR板中，用于高通量擴(kuò)增檢測[8]。

1.3 KASP標(biāo)記轉(zhuǎn)化和引物合成

根據(jù)前人研究結(jié)果，共選用60個SNP位點(diǎn)作為KASP標(biāo)記的篩選庫，分別來自CABEZAS等[21]的46個和LAUCOU等[22]的14個SNP位點(diǎn)。為保證篩選的SNP位點(diǎn)具有基因特異性，從Ensemblplants網(wǎng)站下載SNP位點(diǎn)前后各100 bp的葡萄DNA序列（https://plants.ensembl.org/Vitis_vinifera/Gene），首先在NCBI中進(jìn)行比對（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome；Standard databases為RefSeq Representative genomens；Organism為wine grape (taxid: 29760)），去除非特異性的位點(diǎn)。然后，將SNP位點(diǎn)信息前后各100 bp的特異性DNA序列在建有LGC公司KASP檢測技術(shù)平臺的北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜改良中心設(shè)計并合成引物。其中引物設(shè)計要求兩條正向引物的變性溫度在62.5℃左右，溫差不超過1℃，GC含量在50%—55%；反向引物的變性溫度在66℃，GC含量不超過60%。

1.4 PCR擴(kuò)增與標(biāo)記檢測

PCR反應(yīng)體系（10.14 μL）為KASP Master mix 5 μL、KASP Primer mix 0.14 μL和模板DNA（50 ng·μL-1）5 μL。PCR反應(yīng)條件：第一輪94℃ 15 min；94℃ 20 s，61—55℃ 60 s，10個Touch Down循環(huán)（每個循環(huán)降低0.6℃）；第二輪94℃ 20 s，55℃ 60 s，26個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物使用熒光微孔板檢測儀檢測，然后采用LGC公司開發(fā)的SNP viewer 2.0軟件讀取檢測數(shù)據(jù)[20]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)SNP分型結(jié)果數(shù)據(jù)計算相關(guān)遺傳多樣性參數(shù)，包括MAF（次要等位基因頻率）、PIC（多態(tài)信息含量）[20,25]、Heterozygosity（雜合度）、Missing rate（缺失率）等，均在Excel 2019中使用公式進(jìn)行計算：

式中，P和P是SNP的兩個等位基因在所有被測品種中的發(fā)生頻率，是樣本數(shù)量[20]。

依據(jù)SNP標(biāo)記具有的二態(tài)性特點(diǎn)，將分型數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為二元編碼數(shù)據(jù)，野生型（與葡萄基因組一致）表示為（1、0），突變體表示為（0、1），雜合基因型表示為（1、1），缺失位點(diǎn)記為（999、999）[8]，然后利用PowerMarker V3.25軟件的鄰接算法（Neighbor- joining）計算76個葡萄品種的遺傳距離[26]，并用Figtree v1.4.4構(gòu)建聚類圖。

使用STRUCTURE 2.3.4進(jìn)行貝葉斯聚類[27]，并確定最佳的類群分組。設(shè)定等位變異頻率特征數(shù)（遺傳群體數(shù)）K=1—15，Burn-in周期為100 000，MCMC的重復(fù)次數(shù)為100 000次，采用混合模型和相關(guān)等位基因頻率，對不同的K值進(jìn)行15次重復(fù)運(yùn)行，然后將后綴為“_f”的結(jié)果文件壓縮，上傳到“STRUCTURE HARVESTER”網(wǎng)站（http://taylor0.biology.ucla.edu/ struct_harvest/），根據(jù)Evanno等[28]的方法計算得到?K和似然值的對數(shù)函數(shù)lnp（D），分別針對基因庫數(shù)（K）建模，確定最佳K值。

采用北京市農(nóng)林科院蔬菜改良中心提供的Perl腳本計算出最優(yōu)組合標(biāo)記[20]。

2 結(jié)果

2.1 KASP標(biāo)記轉(zhuǎn)化結(jié)果

對60個SNP位點(diǎn)進(jìn)行特異性分析，與葡萄參考基因組（Standard databases：RefSeq Representative genomens；Organism：wine grape (taxid: 29760)）序列比對后，發(fā)現(xiàn)3個非特異性標(biāo)記，最終57個SNP位點(diǎn)成功設(shè)計出51個KASP標(biāo)記，轉(zhuǎn)化率為89.47%（附表1）。

2.2 KASP標(biāo)記的初篩

利用KASP技術(shù)對23份葡萄品種進(jìn)行基因分型，51個KASP標(biāo)記全部成功分型。其中，MAF值大于0.25的標(biāo)記有31個，PIC值大于0.35的標(biāo)記有35個，缺失率小于0.2的標(biāo)記有44個，雜合率小于0.6的標(biāo)記有50個，同時滿足以上4個條件的標(biāo)記有27個，并用于下一步的復(fù)篩（圖1）。

2.3 KASP標(biāo)記的復(fù)篩及DNA指紋圖譜構(gòu)建

使用初篩出的27個KASP標(biāo)記對76份葡萄品種進(jìn)行基因分型。結(jié)果表明，VIT_3_5724485、VIT_4_680574、VIT_11_5406647、VIT_15_18031506、VIT_18_3829207等5個標(biāo)記分型結(jié)果不具備差異性，并舍棄；其余22個KASP標(biāo)記在76份樣本中均分型成功（圖2）。其中，22個標(biāo)記的缺失率均小于0.12，雜合率在0.4—0.6的占77%，PIC值在0.4—0.5的占95%，MAF值大于0.3的占95%（圖3）。此外，使用篩出的22個KASP標(biāo)記對同一品種不同樹體提取的23份代表性品種的DNA擴(kuò)增檢測，前后兩次檢測的分型結(jié)果一致，表明篩選的22個KASP標(biāo)記具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，可以初步作為一組核心標(biāo)記用于葡萄的品種鑒定。將這22個標(biāo)記獲得的76份葡萄品種分型結(jié)果轉(zhuǎn)化為二元編碼數(shù)據(jù)，得到76份中國主要栽培葡萄品種的SNP指紋圖譜（圖4）。

2.4 76個葡萄品種的聚類分析和群體結(jié)構(gòu)分析

基于22個KASP標(biāo)記的分型結(jié)果，利用PowerMarker V3.25和Figtree v1.4.4軟件繪制76份葡萄品種的聚類圖（圖5-a）。76份葡萄品種可以分為3大類：第Ⅰ大類由19份多倍體歐美雜交品種單獨(dú)聚為一大類（圖5-a中標(biāo)紅色的分枝），其中‘春香無核’‘潤堡早夏’‘天工墨玉’同為‘夏黑’的芽變品種，和‘夏黑’聚在一起；親本之一同為‘紅富士’的‘天工翠玉’‘天工玉液’2份品種也在該大類中，但因另一親本不同，沒有緊密聚在一起；‘巨玫瑰’‘華葡黃玉’‘華葡瑰香’同為‘巨峰’和‘沈陽玫瑰’的雜交后代，和‘巨峰’聚在一起；其他含有‘巨峰’親緣的多倍體品種也與‘巨峰’聚在一起。第Ⅱ大類由39份二倍體品種組成，包含35份歐亞種、3份歐美雜種、1份毛葡萄（圖5-a中標(biāo)綠色的分枝），其中‘早康寶’和‘麗紅寶’、‘翠香寶’和‘秋黑寶’、‘鄭艷無核’和‘慶豐’、‘云楚無核’和‘岳秀無核’、‘瑞都紅玫’‘瑞都脆霞’‘瑞都香玉’‘瑞都早紅’5組分別出自同一雜交組合后代群體的品種，各自聚類在一起；具有‘玫瑰香’親緣關(guān)系的‘脆紅寶’‘晨香’‘卓越玫瑰’‘華葡翠玉’‘華葡早玉’5份品種與‘玫瑰香’聚類在一起；同樣，具有‘紅地球’親緣關(guān)系的‘玉波一號’‘玉波黃地球’‘云楚無核’‘岳秀無核’‘華葡翠玉’‘華葡紫峰’‘紅艷無核’7份品種也與‘紅地球’聚類在一起；‘紅特沙’與親本之一‘里扎馬特’緊密聚在一起。第Ⅲ大類主要由11份歐亞種、3份歐美雜種、3份山歐雜種、1份刺葡萄，共18份品種組成，同為二倍體品種（圖5-a中標(biāo)藍(lán)色的分枝），其中‘赤霞珠’‘北冰紅’‘愛格麗’‘媚麗’‘泰美’‘玉玲瓏’6份釀酒葡萄品種聚在該大類中；‘北冰紅’‘凌豐紅’2份出自同一育種單位的山歐雜交品種，和‘惠良刺葡萄’緊密聚類在一起；‘玉波二號’‘短枝玉玫瑰’同為‘達(dá)米娜’和‘紫地球’的雜交后代，緊密聚在一起；由‘金手指’和‘紫地球’雜交獲得的‘玉珍香’也與‘金手指’聚在該類群中。

A：51個KASP標(biāo)記的名稱（紅色字體為初篩出的27個高質(zhì)量KASP標(biāo)記）；B：葡萄染色體號；C：缺失率；D：雜合率；E：多態(tài)性信息含量；F：次要等位基因頻率

用STRUCTURE 2.3.4進(jìn)行種群遺傳結(jié)構(gòu)相關(guān)性分析，根據(jù)EVANNO等[28]的方法，用最大似然值?K來確定K值。本研究中當(dāng)K=3時，?K取得最大值，推斷76份葡萄品種分為3個類群（圖5-b、圖5-c），Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類分別占總?cè)后w數(shù)的39.47%、38.16%、22.37%，其中Ⅰ類群包含18個歐美雜種品種，占總歐美雜種群體數(shù)（25份）的72.00%，Ⅱ和Ⅲ群體中共包含36份歐亞種品種，占總歐亞種群數(shù)（46份）的78.26%，與聚類分析結(jié)果具有一定的一致性。

2.5 KASP標(biāo)記在品種鑒定中的應(yīng)用

對76份葡萄品種的指紋數(shù)據(jù)比對分析，發(fā)現(xiàn)3組基因型一致的品種分別為：‘夏黑’和‘潤堡早夏’（‘夏黑’的芽變品種），‘天工翠玉’和‘天工墨玉’（同一家育種單位選育的品種），‘里扎馬特’和‘紅特沙’（親本之一為‘里扎馬特’）。采用北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜改良中心提供的Perl腳本計算出一組僅用10個標(biāo)記就能區(qū)分70份品種的最優(yōu)組合標(biāo)記（圖6），有54份葡萄品種達(dá)到品種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)（差異位點(diǎn)數(shù)≥2）[29]。其中，中國主栽的‘紅地球’‘玫瑰香’‘美人指’‘香妃’‘紅寶石無核’‘碧香無核’‘金手指’‘陽光玫瑰’‘赤霞珠’9份葡萄品種含有至少2個KASP標(biāo)記的基因型可區(qū)別于其他品種。新育成的品種中，‘脆紅寶’‘翠香寶’‘早康寶’‘麗紅寶’‘秋黑寶’‘無核翠寶’6份“寶”系列品種，‘瑞都無核怡’‘瑞都科美’‘瑞都脆霞’‘瑞都香玉’‘瑞都早紅’‘瑞都紅玫’6份“瑞都”系列品種，‘玉波一號’‘玉波二號’‘玉珍香’‘短枝玉玫瑰’‘玉波黃地球’5份“玉”系列品種，‘華葡紫峰’‘華葡翠玉’‘華葡早玉’‘華葡黃玉’‘華葡玫瑰’5份“華葡”系列品種，同一親本后代的‘云楚無核’‘岳秀無核’及‘慶豐’‘鄭艷無核’、單親后代的‘MCS2’‘泰美’、山歐雜種的‘北冰紅’‘凌豐紅’‘凌砧1號’、刺葡萄種的‘惠良刺葡萄’以及多倍體‘天工玉液’‘煙葡一號’等品種間均有不少于2個KASP標(biāo)記的差異。

圖2 基于76份葡萄品種，VIT_6_4258638（A）和VIT_16_21202286（B）KASP標(biāo)記熒光檢測結(jié)果

圖3 22個KASP標(biāo)記基于76份葡萄品種獲得的缺失率、雜合度、多態(tài)性信息含量、次要等位基因頻率值在不同范圍內(nèi)所占百分比

第1列：KASP標(biāo)記名稱；第2列：KASP標(biāo)記對應(yīng)的突變堿基類型；其余列：依次為76個主要栽培葡萄品種的基因型

3 討論

中國作為東亞種群的集中分布區(qū)，包含至少38個種[1]，保存各類葡萄種質(zhì)資源達(dá)3 000多份[30]，且中國新育成的葡萄品種數(shù)量還以每年至少20份的速度增長[31]。但由于人們頻繁的引種交流和長期的葡萄傳播過程，同物異名或同名異物的現(xiàn)象時有發(fā)生[2]，如云南‘水晶’、貴州‘水晶’、關(guān)口葡萄實(shí)為尼加拉的同物異名品種，鹽井‘黑珍珠’和茨中‘教堂’葡萄實(shí)為‘巴柯’的同物異名品種[32]。此外，葡萄無性繁殖能力強(qiáng)，成活率高，育種家的成果一旦被竊取，極易被擴(kuò)繁、易名、炒作，不僅侵害育種家的利益，而且加大了葡萄苗木市場的管理難度。

構(gòu)建DNA指紋圖譜技術(shù)（DNA-Fingerprinting）對于快速準(zhǔn)確的品種鑒定和純度鑒定、維護(hù)育種家的利益等具有重大意義[8]。當(dāng)前，研究者已在水稻[29]、玉米[17]、棉花[33]、甘藍(lán)[34]等多種作物中進(jìn)行了以SSR和SNP核心標(biāo)記為主的指紋圖譜構(gòu)建。在葡萄作物上，李貝貝等[6]利用8對引物構(gòu)建國內(nèi)最大群體量的SSR指紋圖譜。但SSR標(biāo)記在實(shí)際應(yīng)用中還存在數(shù)量和檢測通量有限、位點(diǎn)存在一定突變率、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確讀取費(fèi)時耗力、無法有效區(qū)分芽變品種等不足[15]。與SSR相比，SNP是基于單核苷酸的突變，突變頻率更低，遺傳穩(wěn)定性更高，批量檢測時平均每個孔位的使用成本比SSR的低1/10—1/20；同時，SNP也是構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫的推薦標(biāo)記之一，但目前國內(nèi)還沒有利用SNP標(biāo)記構(gòu)建葡萄指紋圖譜的研究[35]。而構(gòu)建SNP指紋圖譜首先要選擇合適的SNP分型技術(shù)。目前，至少有20種SNP分型技術(shù)，其中SEMAGN等[14]以玉米為材料，從轉(zhuǎn)化率、準(zhǔn)確性、成本、靈活性等角度對比分析了KASP和Illumina GoldenGate兩種技術(shù)，認(rèn)為KASP基因分型技術(shù)在少位點(diǎn)檢測大樣本群體時具有更大的優(yōu)勢。趙勇等[36]基于53份大豆材料，使用4個SNP比較GBS、CAPS、KASP三種分型方法，也認(rèn)為KASP技術(shù)更具有靈活實(shí)用性。劉麗華等[9]同樣認(rèn)為KASP技術(shù)可實(shí)現(xiàn)高通量的少量位點(diǎn)檢測大量群體的目的，更適合作物品種鑒定工作。馬麗等[17]、李志遠(yuǎn)等[8]、劉寶平等[37]和LI等[38]基于KASP技術(shù)分別篩選出22個、59個、48個和50個核心KASP標(biāo)記，用于玉米、甘藍(lán)、番茄和白菜等作物的品種鑒定中。

A：鄰接聚類分析；B：K值與?K趨勢變化圖；C：K=3時群體遺傳結(jié)構(gòu)分析圖

1: VIT_15_18567587; 2: VIT_6_4258638; 3: VIT_8_3320936; 4: VIT_12_ 22228357; 5: VIT_11_19390306; 6: VIT_16_17950801; 7: VIT_18_ 11138668; 8: VIT_12_739916; 9: VIT_16_13454358; 10: VIT_16_21202286

本研究基于KASP技術(shù)，利用前人篩選的SNP位點(diǎn)，首次嘗試構(gòu)建我國76份主要栽培葡萄品種的SNP指紋圖譜?；贙ASP分型技術(shù)的檢測原理，選擇的SNP位點(diǎn)需要在群體中穩(wěn)定遺傳、具備高多態(tài)性。同時，為保證分型結(jié)果準(zhǔn)確，篩選的標(biāo)記應(yīng)具有基因組特異性。本研究使用的SNP位點(diǎn)分別來自CABEZAS等[21]對1 324份葡萄材料有效分型驗(yàn)證的46個SNPs和LAUCOU等[22]基于18K SNPs葡萄基因芯片對945份材料篩出的14個SNPs，保證了選擇的位點(diǎn)具有足夠的區(qū)分能力。

為保證構(gòu)建的76份葡萄指紋圖譜的真實(shí)性，本研究基于檢測獲得的基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析和群體分析，兩種分析結(jié)果一致。聚類分析結(jié)果表明所有的多倍體歐美雜種起源于二倍體，但又區(qū)別于二倍體，在聚類圖中單獨(dú)聚為一類。其他二倍體品種分為兩大枝，符合對應(yīng)的親緣關(guān)系，與王富強(qiáng)等[5]基于30對核心SSR引物對52份葡萄品種聚類分析結(jié)果具有一致性，首次驗(yàn)證了KASP分子標(biāo)記可用于研究多倍體和二倍體葡萄之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系，使用KASP標(biāo)記構(gòu)建葡萄指紋圖譜具有可行性。

在品種鑒定分析中，因‘春香無核’‘潤堡早夏’‘天工墨玉’同為‘夏黑’的芽變品種，以及親本之一為‘里扎馬特’的‘紅特沙’，遺傳相似度極高，使用22個KASP標(biāo)記無法有效區(qū)分。只有‘無核白雞心’的芽變品種‘科玉無籽’與‘無核白雞心’含有6個純合基因型的差異，說明芽變品種的鑒定依然是當(dāng)前品種鑒定的難點(diǎn)，需要用更多的標(biāo)記進(jìn)行區(qū)分。而按照SSR分子標(biāo)記的品種有效區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)，本研究獲得的10個標(biāo)記（VIT_15_18567587、VIT_6_4258638、VIT_8_3320936、VIT_12_22228357、VIT_11_19390306、VIT_16_17950801、VIT_18_11138668、VIT_12_739916、VIT_16_13454358、VIT_16_21202286）可完全區(qū)分54份品種，包含了我國主栽的‘紅地球’‘紅寶石無核’‘金手指’‘陽光玫瑰’等品種，以及親緣關(guān)系較近的“寶”系列、“瑞都”系列、“玉”系列、“華葡”系列品種，這與使用SSR標(biāo)記區(qū)分相關(guān)品種具有一致性[5]，表明使用KASP標(biāo)記對葡萄進(jìn)行品種鑒定的實(shí)用性，且比SSR標(biāo)記具有更快更準(zhǔn)、更易判讀等優(yōu)勢。

4 結(jié)論

從60個葡萄SNP位點(diǎn)，成功轉(zhuǎn)化51個KASP標(biāo)記，并篩選出22個高質(zhì)量KASP標(biāo)記，構(gòu)建了76份中國主要栽培葡萄品種的SNP指紋圖譜。經(jīng)鄰接聚類分析和群體結(jié)果分析，可將76份葡萄品種分為3類，并能正確區(qū)分開二倍體和多倍體。僅用10個標(biāo)記就能區(qū)分70份品種，其中有54份品種達(dá)到品種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)（差異位點(diǎn)數(shù)≥2），首次驗(yàn)證了KASP技術(shù)在我國葡萄品種鑒定中的可行性。

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Identification of Grape Cultivars Based on KASP Markers

WANG FuQiang1, ZHANG Jian2, WEN ChangLong2, FAN XiuCai1, ZHANG Ying1, SUN Lei1, LIU ChongHuai1, JIANG JianFu1

1Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450009;2Beijing Vegetable Research Center, Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Beijing 100097

【】This study was aimed to develop a set of kompetitive allele specific PCR (KASP) markers that can be used to distinguish the main cultivated grape cultivars in China, so as to provide the technical support for domestic grape cultivar protection, cultivar registration and market right protection. 【】60 highly polymorphic SNP loci from previous studies in grapes were selected to design KASP markers. 23 representative grape cultivars and 76 main cultivated grape cultivars in China were used for preliminary screening, re-screening, and verification of the successfully transformed KASP markers. A set of high-quality KASP markers was further selected to establish the DNA fingerprint database for the 76 grape cultivars. 【】Among the 60 SNP loci, 3 were not genome-specific, 6 could not be used to design KASP-PCR markers, and 51 could be successfully transformed to KASP markers with a conversion rate of 89.47%. Next, 23 representative grape cultivars were successfully genotyped by using the 51 KASP markers on LGC-SNP line platform. Then, 27 KASP markers of high quality were selected successfully based on the minor allele frequency (MAF) greater than 0.25, polymorphism information content (PIC) greater than 0.35, deletion rate less than 0.2, and heterozygosity rate less than 0.6. Finally, 22 KASP markers were successfully re-screened in the 76 main cultivated grape cultivars. The missing rate of the 22 markers was less than 0.12, the PIC value of them was greater than 0.30, the heterozygosity rate of 0.40-0.60 was 77.27%, and the MAF of greater than 0.30 was 95.45%. In addition, the consistent genotype data were acquired with different trees from each of the 23 representative cultivars by using the 22KASP markers, indicating that these 22 KASP markers had good reproducibility and stability for grape cultivar identification. The SNP genotyping results of 76 grape cultivars based on 22 markers were converted to binary coding data, and the fingerprints of 76 grape cultivars were obtained. Based on neighbor-joining cluster analysis, the 76 grape cultivars could be divided into 3 populations. Diploid and polyploidy cultivars were also correctly identified. The 10 markers (VIT_15_18567587, VIT_6_4258638, VIT_8_3320936, VIT_12_22228357, VIT_11_19390306, VIT_16_17950801, VIT_18_11138668, VIT_12_739916, VIT_16_ 13454358, VIT_16_21202286) were enough to be able to distinguish 70 of the 76 cultivars, of which 54 cultivars met the criteria for variety identification (the number of different loci ≥2). 【】From 60 grape SNPs, 51 KASP markers were successfully transformed, and 22 high-quality KASP markers were selected successfully for developing the fingerprints of the 76 main grape cultivars in China. It was the first time to verify the feasibility of KASP genotyping in the identification of grape cultivars in China.

grape; KASP marker; cultivar identification; fingerprint; genetic diversity analysis

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.13.012

2020-08-26；

2021-01-23

國家重點(diǎn)研發(fā)計劃（2019YFD1001401）、國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-29-yc-1）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP- 2019-ZFRI）

王富強(qiáng)，E-mail：82101185031@caas.cn。通信作者姜建福，E-mail：jiangjianfu@caas.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）