陳曉慧，李 清，冶貴生*

(1.青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧，810016；2.青海大學(xué) 省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧，810016)

歐拉型藏羊主要分布在青藏高原，由于受到地理環(huán)境等因素的影響，歐拉型藏羊擁有較高的抗寒性與抗病性[1]。為了提高藏羊?qū)膊〉牡挚沽Γl(fā)掘藏羊抗病免疫基因?qū)ζ浞N質(zhì)資源的開發(fā)具有重要意義。早在20世紀(jì)末，Parrish-Novak等[2]提出白細(xì)胞介素-21(IL21)。IL21主要是由濾泡輔助T 細(xì)胞(Tfh)、輔助性T細(xì)胞17(Th17)和自然殺傷細(xì)胞(NK)產(chǎn)生[3-4]，可增強(qiáng)CD+8 T細(xì)胞的擴(kuò)增和CD+4 T細(xì)胞向效應(yīng)T細(xì)胞的分化[5-6]。IL21受體(IL21Rα)可有助于B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞等細(xì)胞的增殖與分化，IL21與其受體IL21Rα連接可促進(jìn)B細(xì)胞依賴性Ig G產(chǎn)生，從而增強(qiáng)細(xì)胞毒性和提高殺傷能力[7-8]。IL21作為一種多效性細(xì)胞因子，在先天性免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用，與多種自身免疫性疾病有關(guān)。IL21能抑制腫瘤的生長繁殖，通過促使合成IFN-γ在抗腫瘤中有著良好效果[9]。IL21最開始對Th1細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，使得機(jī)體細(xì)胞對病毒有一定的免疫效果，合成大量IFN-γ，這對NK細(xì)胞的增殖和CTL效應(yīng)有著一定的推動(dòng)作用；IL21還可以通過聯(lián)合其他細(xì)胞因子活化STAT1和STAT3等信號通路[10]，不但對細(xì)胞的毒活性有所提升，更是可以良好的促進(jìn)IFN-γ分泌，使得效應(yīng)T細(xì)胞和NK細(xì)胞可以更好地工作，實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤生長的效果[11-12]。另外，在HIV感染的患者中，IL21提高了CD+8 T細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌穿孔素以此來抑制HAVD的復(fù)制[13]，控制HIV感染。由于IL21對HIV患者的T細(xì)胞、NK細(xì)胞和B細(xì)胞可以起到一個(gè)較好的改善效果，所以在對HIV患者的診斷與該病毒的研究途中，IL21可作為重要的生物標(biāo)志物[14]。劉秀煥等[8]發(fā)現(xiàn)加強(qiáng)IL21的功能有利于癌癥、HIV感染等疾病的治療，但在一些免疫系統(tǒng)疾病如SLE和RA中，降低IL21的作用可提高臨床療效。目前關(guān)于藏羊IL21的研究未見報(bào)道，本研究使用PCR方法擴(kuò)增了藏羊IL21基因，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，為歐拉型藏羊IL21免疫調(diào)控機(jī)理的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI登錄的綿羊IL21基因序列，使用oligo引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)歐拉型藏羊IL21基因擴(kuò)增引物，由TaKaRa公司(大連)合成。引物序列如下：IL21-F：5'-CACAAGTCAAGCTTCCAA-3'，IL21-R： 5'-GGACAGATGCTGATGAATC-3'，目的基因長度387 bp。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)樣品歐拉型藏羊的脾臟組織采自青海省河南縣屠宰場，由青藏高原動(dòng)物疾病研究室采集、液氮速凍，-80 ℃冷凍保存。

1.3 試驗(yàn)試劑

RNA 提取試劑盒由 Aidlab Biotechnologies Co. Ltd提供；Prime Script 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、預(yù)混液由 TaKaRa 公司(大連)提供。

1.4 提取總 RNA

取歐拉型藏羊的脾臟組織通過液氮研磨成末狀，根據(jù)試劑盒說明書提取總 RNA。

1.5 反轉(zhuǎn)錄 cDNA

提取的歐拉型藏羊脾臟總 RNA通過反轉(zhuǎn)錄為 cDNA (操作依說明書)。

1.6 PCR 擴(kuò)增

IL21基因的 PCR 合成體系：預(yù)混液 Premix Taq 25 μL、ddH2O 18 μL、模板 cDNA 5 μL、IL21 基因上、下游引物各1 μL。

反應(yīng)條件：94 ℃ 1 min、50 ℃ 50 s、72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min 延伸，4 ℃ 保存。

1.7 IL21基因序列分析

將擴(kuò)增產(chǎn)物送至測序公司進(jìn)行測序，然后進(jìn)行IL21基因核苷酸序列分析和同源性比對分析。

1.8 IL21 蛋白結(jié)構(gòu)分析

使用 DNAStar、PredictProtein、I-Tasser 在線服務(wù)器對 IL21 蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 IL21基因 PCR 擴(kuò)增

經(jīng)過凝膠電泳檢測，應(yīng)用IL21基因特異引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物大小約為 387 bp，與預(yù)期片段大小相符(如圖1)，條帶特異性強(qiáng)。

圖1 IL21基因 PCR 擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳M. DNA Marker;1.陰性對照;2. PCR產(chǎn)物Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of IL21 gene PCRM. DNA Marker;1. Negative control;2. PCR product

2.2 IL21基因核苷酸序列分析

序列分析結(jié)果表明(表1)，IL21基因片段長度為 387 bp，在堿基組成中腺嘌呤含量占 35.92%,且AT含量高于GC含量。

2.3 IL21基因同源性比對分析

本研究將歐拉型藏羊IL21基因與不同種類羊和不同種類牛的IL21基因核苷酸序列、氨基酸序列同源比對。用來做對比分析羊的種類包括山羊、綿羊和藏羚羊等；用來作對比分析牛的種類包括水牛、牦牛、瘤牛和美洲草原野牛等。結(jié)果表明歐拉型藏羊IL21基因與參考綿羊(登錄號:NM_001256817.1)核苷酸序列同源性最高，為100%；與參考藏羚羊(登錄號: XM_005971185.1)核苷酸序列同源性為99.5%；與參考山羊(登錄號: XM_005691285.2)核苷酸序列同源性為99.0%，僅次于藏羚羊；與參考美洲草原野牛(登錄號:XM_010860276.1)核苷酸序列同源性為98.4%；與參考牦牛(登錄號: XM_005899735.1)核苷酸序列同源性為98.4%；與參考水牛(登錄: XM_006078950.2)核苷酸序列同源性為98.2%；與參考瘤牛(登錄號: XM_019977155.1)核苷酸序列同源性為98.2%。另外，氨基酸序列同源性依次為100%、100%、100%、98.4%、98.4%、98.4% 和97.7%，如圖 2 和圖 3 所示。

表1 IL21基因核苷酸序列分析Table 1 Nucleotide sequence analysis of IL21 gene

2.4 IL21蛋白結(jié)構(gòu)分析

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，IL21 蛋白中 α 螺旋占 53.5%，其次是 β 轉(zhuǎn)角占 27.1%，β 折疊最少，為 2.33%(圖4)；親水性分析結(jié)果顯示，IL21 蛋白質(zhì)的主要親水區(qū)是1～13、26～35、37～50、57～71、77～99、101～115、121～129(如圖5)；表面可及性分析表明，該蛋白在 1～8、24～28、39～43、61～70、77～94、102～116 位氨基酸呈現(xiàn)表面可及性較大(圖6)；IL21 蛋白三級結(jié)構(gòu)模型見圖7。

圖2 IL21基因核苷酸序列同源比對Fig. 2 The nucleotide sequence homology of IL21 gene

圖3 IL21蛋白氨基酸序列同源比對Fig.3 The amino acid homology of IL21 protein

圖4 IL21 蛋白二級結(jié)構(gòu)Fig. 4 Secondary structure of IL21 protein

圖5 IL21 蛋白親水性Fig. 5 Hydrophilicty of IL21 protein

圖6 IL21 蛋白表面可及性Fig. 6 Surface accessibility of IL21 protein

圖7 IL21 蛋白三級結(jié)構(gòu)模型Fig. 7 Tertiary structure model of IL21 protein

2.5 蛋白功能位點(diǎn)預(yù)測

通過對歐拉型藏羊IL21蛋白功能位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白含有 1 個(gè)酰胺化位點(diǎn)，為88～91 位的AGRR；1個(gè)亮氨酸拉鏈模式，為11～33位LFIRLRQLIDIVDQLKNYVNDL。

3 討 論

藏羊作為青藏高原的優(yōu)良品種，具有抗病性強(qiáng)的種質(zhì)特征，因此發(fā)掘歐拉型藏羊抗病免疫基因，對其種質(zhì)資源的開發(fā)具有重要研究意義。IL21作為免疫機(jī)制輔助因子，在調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答機(jī)制中發(fā)揮重要作用，研究發(fā)現(xiàn)IL21可視為B細(xì)胞的免疫抑制因子，用于阻止免疫球蛋白合成[15]。IL21R是由人類幼稚B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞和生發(fā)中心B(GCB)細(xì)胞以及漿細(xì)胞分泌[16-17]，分泌的IL21R又能反向調(diào)節(jié)B細(xì)胞的增殖分化及其功能，可提高B細(xì)胞等免疫細(xì)胞的免疫功能和活性[18]。IL21與IL21R的結(jié)合通過酪氨酸激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK-STAT)信號通路進(jìn)行信號傳導(dǎo)[19]。此通路經(jīng)過激活JAK1與JAK3激酶的催化活化導(dǎo)致IL21R上的酪氨酸殘基被磷酸化，從而為STAT蛋白和其他信號分子提供結(jié)合位點(diǎn)[20]。被磷酸化的STAT與同源二聚體或異二聚體發(fā)生二聚化后，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中并通過參與調(diào)節(jié)靶基因來調(diào)控B細(xì)胞[21-22]。目前，關(guān)于藏羊IL21基因方面研究報(bào)道很少，本研究使用PCR方法成功擴(kuò)增出歐拉型藏羊IL21基因，對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，此研究結(jié)果可為藏羊IL21基因抗病功能研究提供參考依據(jù)。

本研究通過分析歐拉型藏羊IL21基因序列和同源性比對結(jié)果，發(fā)現(xiàn)歐拉型藏羊IL21基因與羊亞科類動(dòng)物如綿羊、藏羚羊和山羊IL21基因的核苷酸序列同源性較高，均達(dá)到99.0% 以上，而與牛亞科動(dòng)物如美洲草原野牛、牦牛、水牛和瘤牛IL21基因的核苷酸序列同源性低于羊亞科類動(dòng)物，結(jié)果均在98.2%～98.4%之間，說明IL21基因具有一定的種屬特異性，種族越相近，其同源性越高，并且兩者相差僅有1%左右，說明IL21基因具有一定的保守性。胡春榮等[23]發(fā)現(xiàn)在小鼠和人類中表達(dá)螺旋A和D區(qū)時(shí)，IL21保守性很高。

蛋白質(zhì)的卷曲螺旋具有多元化的作用，包括細(xì)胞骨架、寡聚化結(jié)構(gòu)域及跨膜信號的調(diào)節(jié)等。由于肽鏈中的全部肽鍵都可形成氫鍵，因此蛋白質(zhì)的α螺旋十分穩(wěn)定，可牢固的維持蛋白的高級結(jié)構(gòu)。β轉(zhuǎn)角是較為松散的結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性低。本研究結(jié)果表明，在歐拉型藏羊IL21蛋白主要由α螺旋組成，占53.5%，表明 IL21蛋白穩(wěn)定很好；且歐拉型藏羊IL21蛋白的77～115 區(qū)域親水性指數(shù)高和蛋白表面可及性較大，這為研究藏羊IL21蛋白的免疫功能提供了理論依據(jù)。

蛋白質(zhì)的翻譯后修飾在生命活動(dòng)中起著重要作用，可以讓蛋白質(zhì)的構(gòu)成更豐富，使其功能具有多樣性和完整性。經(jīng)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示IL21蛋白含有酰胺化修飾位點(diǎn)和亮氨酸拉鏈區(qū)域。其中酰胺化修飾在蛋白質(zhì)翻譯中比較常見，是蛋白質(zhì)翻譯后修飾種類中的第4大類型，由于其發(fā)生于肽的C末端，所以也被叫做C-末端酰胺化。酰胺化修飾在動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)中普遍存在，超過一半的活性肽都存在此過程，在很多神經(jīng)肽的生物活性中起著重要作用[24]。酰胺化不但可以作為生物活性肽與受體識別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要因子，可能在提高多肽與受體親和力方面具有顯著作用，而且還與多種疾病如癌癥和高血壓等有關(guān)[25-26]。亮氨酸拉鏈 (BZIP) 蛋白是真核生物的轉(zhuǎn)錄因子和阻遏蛋白中最大且最保守的家族之一，在哺乳動(dòng)物等真核生物中都發(fā)揮重要作用[27-28]，如在哺乳動(dòng)物中具有抑制或者促進(jìn)基因的翻譯的作用。亮氨酸拉鏈越短其靈活可變性就越小，穩(wěn)定性越高[29]；然而較長的拉鏈?zhǔn)菫榱四芘c特定配體結(jié)合，有著更好的二聚體特異性，但是穩(wěn)定性較差。有些亮氨酸拉鏈的N端包含一些額外的DNA結(jié)合分子,這樣可以增加DNA的穩(wěn)定性[30]。蛋白質(zhì)翻譯后修飾對其蛋白的結(jié)構(gòu)與功能具有重要意義，所有蛋白質(zhì)都需要經(jīng)過翻譯后修飾，其結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜功能更加完整，才可表現(xiàn)出正常的生物學(xué)活性。

4 結(jié) 論

歐拉型藏羊IL21基因長度為387 bp(無終止密碼子)，與參考綿羊、藏羚羊、山羊、美洲草原野牛、牦牛、水牛和瘤牛的IL21基因核苷酸序列同源性依次為100%、99.5%、99.0%、98.4%、98.4%、98.2%和98.2%；氨基酸序列同源性依次為100%、100%、100%、98.4%、98.4%、98.4% 和97.7%，藏羊與綿羊的親緣性最高。IL21蛋白主要由α螺旋組成，是一種親水性蛋白，含有酰胺化位點(diǎn)和亮氨酸拉鏈模式兩種蛋白功能修飾位點(diǎn)。