盧錦斌，張利敏

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西華秦農(nóng)牧科技有限公司，陜西 楊凌 712100)

飼料原料蛋白質(zhì)含量測(cè)定是飼料生產(chǎn)過程中的重要環(huán)節(jié)。目前測(cè)定飼料原料及產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量的方法主要有凱氏定氮法和近紅外光譜法[1-2]。盡管近紅外光譜分析技術(shù)具有檢測(cè)速度快、無損、不消耗試劑、前處理簡單以及可同時(shí)檢測(cè)多種成分等多方面的優(yōu)勢(shì)，但凱氏定氮法仍然是檢測(cè)飼料蛋白質(zhì)含量的重要方法。傳統(tǒng)的凱氏定氮法存在一個(gè)明顯的弊端，即耗時(shí)過長，僅消煮樣品就需3～3.5 h，既影響工作效率又消耗能量。因此，通過改良縮短凱氏定氮法的消煮時(shí)間具有較大的應(yīng)用價(jià)值。

消化環(huán)節(jié)的改良通常從催化劑和消化液兩個(gè)方面入手。傳統(tǒng)凱氏定氮法的催化劑為CuSO4·5H2O與K2SO4(1:15)混合催化劑。濃H2SO4與混合催化劑組合法消化充分，但由于消泡問題未得到解決，無法實(shí)現(xiàn)快速分解。早期有不少研究報(bào)道，利用H2O2與濃硫酸發(fā)生的劇烈反應(yīng)消化樣品可極大地縮短消化時(shí)間，原因是H2O2有助于消泡，且適當(dāng)加大H2O2的量可促樣品快速分解，且減少電能消耗[3-5]，這種改良的凱氏定氮法也被稱為雙氧水測(cè)定法。但不同研究報(bào)道中H2O2添加量以及消煮時(shí)間并不統(tǒng)一，且該方法測(cè)定值與凱氏定氮法測(cè)定值并不相等，各報(bào)道也沒有驗(yàn)證不同飼料原料用該方法與用凱氏定氮法測(cè)定的蛋白質(zhì)含量值的比值是否相同，以及同一類型原料不同來源的樣品該比值是否相同。這些問題沒有解決導(dǎo)致該方法不能得到推廣應(yīng)用。鑒于該方法對(duì)原料的快速消化特點(diǎn)，有必要對(duì)其進(jìn)一步研究，以便在實(shí)際生產(chǎn)中能夠利用其優(yōu)勢(shì)。本研究通過系列試驗(yàn)，確定H2O2的添加比例以及消煮時(shí)間，并分析討論該方法的穩(wěn)定性。在此基礎(chǔ)上，通過比較和分析不同飼料原料凱氏定氮法(即國標(biāo)法)和改良凱氏定氮法蛋白質(zhì)含量測(cè)定值的比值，探討將該方法應(yīng)用于飼料原料蛋白質(zhì)含量測(cè)定的可行性。

1 材料與方法

1.1 飼料原料

玉米、麩皮、豆粕、棉粕、DDGS、玉米蛋白粉、魚粉均由本地企業(yè)提供。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理和試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以四分法采集所需樣品，置于65 ℃風(fēng)干后，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過40目篩后保存。每次試驗(yàn)所有樣品都同時(shí)采用改良方法和傳統(tǒng)凱氏定氮法同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品每種方法均設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 試驗(yàn)方法 首先利用H2O2完全替代凱氏定氮法中的混合催化劑(即H2O2直接催化法)進(jìn)行消化。設(shè)定H2O2與濃硫酸的比例為1:1，選取常規(guī)凱氏定氮法中常用的濃硫酸添加量12 mL，因此 H2O2的添加量也為12 mL。由于H2O2只對(duì)焦化后的有機(jī)物進(jìn)行氧化，因此，測(cè)定時(shí)先稱取0.5 g樣品于消化管中，再加入12 mL濃硫酸，靜置幾分鐘待樣品焦化后，緩慢加入等體積的H2O2，樣品在濃硫酸與H2O2的作用下被分解消化，然后再進(jìn)行蒸餾定氮和滴定。

H2O2替代部分混合催化劑測(cè)定法(即H2O2-混合催化劑法)具體操作如下：0.5 g樣品添加7.5 mL H2O2，H2O2與濃硫酸比例仍為1:1，同時(shí)添加4 g混合催化劑(為凱氏定氮法添加量的1/2)。測(cè)定時(shí)，先稱取0.5 g樣品和4 g混合催化劑于消化管中，再加入7.5 mL濃硫酸，置于已預(yù)熱好的消化爐中消化約5 min待樣品焦化后緩慢加入7.5 mL的H2O2，然后置于消化爐消化20 min左右，最后再進(jìn)行蒸餾定氮和滴定。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 18.0軟件中的單因素方差分析，其余數(shù)據(jù)使用SPSS軟件中的成對(duì)樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 H2O2直接催化法測(cè)定結(jié)果

首先選取低蛋白含量的玉米和高蛋白含量的豆粕進(jìn)行測(cè)定。凱氏定氮法在消化階段耗時(shí)3～3.5 h，而利用H2O2直接催化法可以看到在H2O2與濃硫酸的劇烈反應(yīng)下，樣品迅速消化，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，消化液顏色逐漸變淡直至透明，5 min內(nèi)溶液基本澄清，10 min內(nèi)反應(yīng)趨于平靜,但為充分消化，共消化20 min。將凱氏定氮法所測(cè)值與12 mL H2O2直接催化法所測(cè)值進(jìn)行比較分析，結(jié)果如表1所示。用H2O2完全替代催化劑配合濃硫酸對(duì)樣品進(jìn)行消化，測(cè)定的樣品蛋白質(zhì)含量低于凱氏定氮法測(cè)定的蛋白質(zhì)含量。其中，玉米凱氏定氮法所測(cè)值與H2O2直接催化法所測(cè)值的比值均值為1.240，而豆粕凱氏定氮法所測(cè)值與H2O2直接催化法測(cè)值的比值均值為1.189，比值差異極顯著(P=0.005)。但兩種原料測(cè)定值比值組內(nèi)RSD (relative standard deviation, RSD)均小于3%。

為了檢測(cè)不同原料兩種方法蛋白質(zhì)測(cè)定值比值是否都不相等，又選取4種不同蛋白含量原料的樣品進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果如表2所示，每種原料不同重復(fù)比值RSD<1%，但不同原料兩種方法測(cè)定值的比值都不相同，蛋白質(zhì)含量越高的樣品，兩種測(cè)定值的比值越大，顯示該方法消化并不充分。不同原料H2O2直接催化法測(cè)定值與凱氏定氮法測(cè)定值的比值存在極顯著的差異(P<0.01)。

表 1 玉米和豆粕蛋白質(zhì)含量凱氏定氮法與H2O2直接催化法測(cè)定值比值Table 1 The ratios of protein content in corn and soybean mealdetermined by Kjeldah method and H2O2 direct catalysis method

表2 凱氏定氮法與H2O2直接催化法測(cè)定不同原料的蛋白質(zhì)含量Table 2 Determination of protein content in different samplesby Kjeldah method and H2O2 direct catalysis method

2.2 H2O2-混合催化劑法測(cè)定結(jié)果

上述結(jié)果顯示單獨(dú)使用H2O2原料消化不充分。為使原料成分充分消化，試驗(yàn)調(diào)整了催化劑的配方，采用H2O2-混合催化劑法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 樣品蛋白質(zhì)含量H2O2-混合催化劑法測(cè)定值與凱氏定氮法測(cè)定值及其比值Table 3 Protein content of samples determined by H2O2-mixed catalyst method and Kjeldah method and their ratio

由表3可知，各組樣品H2O2-混合催化劑法與凱氏定氮法測(cè)定值的比值RSD均<3%，顯示比值大小穩(wěn)定，但不同原料該比值仍然不相等，不同原料比值大小與其蛋白質(zhì)含量無關(guān)。其中DGGS該比值最低，接近1；豆粕和魚粉該比值相近(P>0.05)，分別為1.062和1.056，而玉米和玉米蛋白粉比值最高，且兩種原料的該比值接近(P>0.05)，分別為1.129和1.126。

在凱氏定氮法中，樣品的消化溫度在360～410

℃之間，低于360 ℃樣品中的氮消化不完全，高于410 ℃則容易造成氮的損失，因此在該法中設(shè)定的溫度為360 ℃，符合要求范圍。消化時(shí)間是影響消化效果的另一關(guān)鍵因素，為探究在H2O2-混合催化劑法中消化時(shí)間對(duì)于測(cè)定結(jié)果的影響，本試驗(yàn)接下來選取蛋白質(zhì)含量適中、在上述兩類方法中表現(xiàn)都較為穩(wěn)定的豆粕作為樣品，以H2O2-混合催化劑法進(jìn)行試驗(yàn)，消化時(shí)間分別設(shè)定為5、10、15、20、25、30 min。由圖1可以看出，消化時(shí)間在5～20 min內(nèi)，豆粕中蛋白質(zhì)含量隨著消化時(shí)間的延長而提高，但從20 min至30 min，蛋白質(zhì)含量測(cè)定值沒有變化。因此可以推測(cè)在H2O2-混合催化劑法中，當(dāng)消化溫度為360 ℃、總消化時(shí)間為20 min時(shí)，樣品蛋白質(zhì)含量的測(cè)定值可以達(dá)到最高值，說明不同原料兩種方法測(cè)定結(jié)果比值不相等的原因并非消化時(shí)間不充分所致。

圖1 不同消化時(shí)間對(duì)混合催化劑法測(cè)定結(jié)果的影響Fig. 1 Effects of different digestion time on thedetermination results of mixed catalyst method

為了檢測(cè)不同來源同種原料H2O2-混合催化劑法與凱氏定氮法測(cè)定值比值是否穩(wěn)定，在前述結(jié)果的基礎(chǔ)上，又測(cè)定了3種來源玉米和3種來源DDGS，其結(jié)果見表4，不同來源玉米H2O2-混合催化劑法與凱氏定氮法測(cè)定值比值接近(RSD=0.22%)。同樣，不同來源DDGS的H2O2-混合催化劑法與凱氏定氮法測(cè)定值比值也很接近(RSD=0.30%)。

表4 不同來源同種飼料蛋白質(zhì)含量H2O2-混合催化劑法與凱氏定氮法測(cè)定值及其比值Table 4 Protein content of the same feed with different sources determined by Kjeldah method and H2O2-mixedcatalyst method(HMC)and their ratio

3 討 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，H2O2直接催化法雖然比凱氏定氮法節(jié)省了大量的時(shí)間和能源，但其測(cè)定值與凱氏定氮法測(cè)定值相差較大，蛋白質(zhì)含量越高的原料，兩種方法的比值相差越大，顯示H2O2直接催化法消化不充分。H2O2完全替代催化劑的H2O2直接催化法所測(cè)值雖然小于凱氏定氮法測(cè)定值，但對(duì)于同一樣品而言，每種原料不同重復(fù)比值RSD<2%，說明該方法測(cè)定值的比值是穩(wěn)定的，因?yàn)榻y(tǒng)計(jì)學(xué)上認(rèn)為某組數(shù)據(jù)RSD<3%時(shí)即可認(rèn)為該組各數(shù)值穩(wěn)定。與趙德志等[5]報(bào)道的結(jié)果不一致的是，玉米兩種測(cè)定方法比值與豆粕兩種方法測(cè)定比值差異極顯著，說明不能根據(jù)H2O2直接催化法測(cè)定結(jié)果、再根據(jù)同一比值去推算其他檢測(cè)樣品的凱氏定氮法測(cè)定值。

由于使用H2O2直接催化法測(cè)定蛋白含量時(shí)原料消化不充分，參考苗雪原[6]報(bào)道，本試驗(yàn)又采用H2O2-混合催化劑法進(jìn)行測(cè)定，所測(cè)CP含量與凱氏定氮法所測(cè)CP含量仍然存在差異，但與H2O2直接催化法測(cè)定值相比，該方法測(cè)定值更接近凱氏定氮法所測(cè)值，而且每種原料兩種測(cè)定方法的比值大小與原料蛋白質(zhì)含量沒有相關(guān)性。蛋白質(zhì)含量最低的玉米凱氏定氮法與H2O2-混合催化劑法測(cè)定值比值反而高于魚粉和豆粕，而玉米蛋白粉該比值與玉米該比值相等。這些結(jié)果說明，該比值與蛋白質(zhì)含量無關(guān)，而與原料種類有關(guān)。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能是因?yàn)椴煌霞?xì)胞壁結(jié)構(gòu)等不同，使得蛋白質(zhì)消化程度不同。

本試驗(yàn)最后檢測(cè)了不同來源的玉米與DDGS樣品H2O2-混合催化劑法與凱氏定氮法測(cè)定的蛋白質(zhì)含量，結(jié)果顯示，不同來源的玉米和不同來源的DDGS，兩種測(cè)定方法的比值都非常穩(wěn)定，再次證實(shí)H2O2-混合催化劑法與凱氏定氮法測(cè)定值的比值大小與原料種類有關(guān)。本結(jié)果為利用H2O2-混合催化劑法測(cè)定單一原料蛋白質(zhì)含量的可靠性提供了證據(jù)。

4 小 結(jié)

同一種原料蛋白質(zhì)含量用H2O2直接法和H2O2-混合催化劑法測(cè)定時(shí)，均極大地縮短消化時(shí)間，但其測(cè)定值均低于凱氏定氮法測(cè)定值，H2O2-混合催化劑法測(cè)定結(jié)果更接近凱氏定氮法，且消化20 min可獲得穩(wěn)定的測(cè)定值。不同原料H2O2-混合催化劑法與凱氏定氮法測(cè)定值的比值不相等，但不同來源同種原料樣品該比值穩(wěn)定，說明不同原料未充分消化或氮損失部分與原料蛋白質(zhì)含量無關(guān)，而與原料種類有關(guān)。因此，不能根據(jù)某種原料的H2O2-混合催化劑法與凱氏定氮法蛋白質(zhì)測(cè)定值的比值來推測(cè)其他原料的該比值，但可以通過建立不同單一原料凱氏定氮法蛋白質(zhì)測(cè)定值與H2O2-混合催化劑法蛋白質(zhì)測(cè)定值的比值數(shù)據(jù)庫，利用H2O2-混合催化劑法快速測(cè)定單一飼料原料的蛋白質(zhì)含量。