嚴(yán)萬能 馬海潔 樂婷 陳冬冬 李世波 張國強 王婕

肝癌是全球常見的惡性腫瘤之一，其中肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）死亡人數(shù)居世界癌癥致死人數(shù)第3位，發(fā)病率列第6位[1]。隨著近代分子生物學(xué)研究的進展，分子靶向治療已成為除手術(shù)、放療、化療以外的第4種主要腫瘤治療方式，并且相比傳統(tǒng)化療藥物具有靶向性強和不良反應(yīng)少的優(yōu)點。目前索拉非尼和侖伐替尼已成為治療晚期HCC的一線靶向用藥，但其耐藥性導(dǎo)致患者的5年生存率并不理想[2-3]。因此，尋找更加有效的HCC治療靶標(biāo)有著重要的臨床意義。

在HCC發(fā)生、發(fā)展過程中，肝臟的一系列特異性代謝功能受損的同時又獲得了新的代謝特征，腫瘤細(xì)胞惡性程度隨之升高[4]，其中葉酸循環(huán)是主要的代謝失調(diào)通路之一[5]。葉酸循環(huán)涉及的主要代謝酶有亞甲基四氫葉酸脫氫酶1（methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 1 like,MTHFD1L）、亞甲基四氫葉酸脫氫酶2（methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 2,MTHFD2）及絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶2（serine hydroxymethyl transferase 2,SHMT2）等，其中MTHFD2是一種位于線粒體中的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸依賴性雙功能酶，在線粒體葉酸代謝中呈高表達水平[6]。近年來多項研究表明MTHFD2的過表達可促進乳腺癌、結(jié)腸癌、膠質(zhì)瘤等類型腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，而關(guān)于MTHFD2對HCC細(xì)胞凋亡進程的影響仍是未知[7-10]。因此，本研究探討MTHFD2對人HCC細(xì)胞凋亡的影響及其分子機制，以期為HCC患者的臨床治療研究開辟新的方向。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系與培養(yǎng)方式 人HCC細(xì)胞系HepG2和SMMC-7721均來自舟山醫(yī)院細(xì)胞分子生物實驗室；FBS與胰酶均購自美國Gibco公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司。培養(yǎng)方式為含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基于37°C、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48 h后0.25%胰酶消化傳代。

1.1.2 抗體 兔源單克隆抗體MTHFD2（1∶1 000）、酶原型聚二磷酸腺苷-核糖聚合酶（Pro PARP）、剪切型聚二磷酸腺苷-核糖聚合酶（Cleaved PARP）、酶原型半胱天冬酶 3（Pro Caspase-3）、剪切型半胱天冬酶 3（Cleaved Caspase-3）、酶原型半胱天冬酶 7（Pro Caspase-7）、剪切型半胱天冬酶7（Cleaved Caspase-7）、p53正向凋亡調(diào)節(jié)因子（Puma）、BH3交叉域互作介導(dǎo)蛋白（Bim）、BH3交叉域死亡受體激動蛋白（Bid）、BH3關(guān)聯(lián)死亡啟動子（Bad）、BH3交叉域互作殺傷蛋白（Bik）、BH3關(guān)聯(lián) K 蛋白（Bak）、BH3關(guān)聯(lián) X蛋白（Bax）、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗均購自美國Cell Signaling Technology公司；β-actin購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 試劑 MTHFD2-siRNA#1、MTHFD2-siRNA#2、Puma-siRNA、陰性對照劑Ctrl-siRNA均由廣州銳博生物有限公司合成；Lipo3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Thermo Fisher公司；流式細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；CCK-8檢測試劑盒購自中國Biosharp生物有限公司；ECL檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher公司。siRNA序列如下：MTHFD2-siRNA#1 5'-GGAAGGAG CAGCAGTCATT-3'，MTHFD2-siRNA#2 5'-GGATCAGTATTCCATGTTA-3'；Puma-siRNA 5'-GCCUG UAAGAUACUGUAUA。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組 將對數(shù)生長期的HepG2和SMMC-7721細(xì)胞隨機分為siMTHFD2#1組、siMTHFD2#2組和siCtrl組3組。各組常規(guī)培養(yǎng)24 h，用Lipo3000分別轉(zhuǎn)染 MTHFD2-siRNA#1、MTHFD2-siRNA#2 及 Ctrl-siRNA。另將對數(shù)生長期的SMMC-7721細(xì)胞隨機分為siMTHFD2+siPuma組、siMTHFD2組、siPuma組和 siNC組4組，培養(yǎng)24 h后分別進行MTHFD2-siRNA和Puma-siRNA共轉(zhuǎn)染、MTHFD2-siRNA轉(zhuǎn)染、PumasiRNA轉(zhuǎn)染、Ctrl-siRNA轉(zhuǎn)染。

1.2.2 MTHFD2、凋亡通路相關(guān)蛋白、B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）家族蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。轉(zhuǎn)染72 h后收集不同處理組的細(xì)胞，RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。經(jīng)過10%SDS-PAGE凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)至0.45 μm PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4°C孵育過夜，TBST洗膜5 min，3次后二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜5 min，3次。ECL發(fā)光液孵育，顯影曝光后利用Image J 1.8.0進行灰度分析。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin內(nèi)參條帶灰度值。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 細(xì)胞凋亡率檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。轉(zhuǎn)染72 h后收集不同處理組的細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌后加入結(jié)合緩沖液混勻。每組細(xì)胞各加膜粘連蛋白5（Annexin V）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液，室溫避光孵育20 min后流式細(xì)胞儀檢測，以Annexin V陽性的凋亡細(xì)胞比例作為凋亡率進行統(tǒng)計。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 細(xì)胞增殖能力檢測 采用CCK-8實驗。將轉(zhuǎn)染72 h后不同處理組的細(xì)胞以2×103個/孔種于96孔板，每組設(shè)3個復(fù)孔，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于24、48、72、96 h加入 10%CCK-8試劑，37 °C 培養(yǎng) 2 h后利用酶標(biāo)儀于450 nm處檢測光密度（OD）值，繪制細(xì)胞生長曲線。實驗重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 3組HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中MTHFD2表達水平比較 HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中siMTHFD2#1組和siMTHFD2#2組的MTHFD2表達水平均明顯低于siCtrl組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.01），見表 1、圖 1。

圖1 3組HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中亞甲基四氫葉酸脫氫酶2（MTHFD2）表達的電泳圖

表1 3組HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中MTHFD2表達水平比較

2.2 3組HepG2和SMMC-7721細(xì)胞凋亡率比較 HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中siMTHFD2#1組和siMTHFD2#2組的細(xì)胞凋亡率均明顯高于siCtrl組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.01），見表 2、圖 2。

圖2 3組HepG2和SMMC-7721細(xì)胞凋亡率的流式細(xì)胞圖

表2 3組HepG2和SMMC-7721細(xì)胞凋亡率比較（%）

2.3 3組HepG2和SMMC-7721細(xì)胞凋亡通路相關(guān)蛋白表達水平比較 與siCtrl組比較，siMTHFD2#1組和siMTHFD2#2組HepG2和SMMC-7721細(xì)胞的Cleaved Caspase3/Pro Caspase3、Cleaved Caspase7/Pro Caspase7 比值均明顯升高，siMTHFD2#1組和siMTHFD2#2組SMMC-7721細(xì)胞的Cleaved PARP/Pro PARP比值均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.05）。見圖 3、表 3、4。

表3 3組HepG2細(xì)胞凋亡通路相關(guān)蛋白表達水平比較

表4 3組SMMC-7721細(xì)胞凋亡通路相關(guān)蛋白表達水平比較

圖3 3組HepG2和SMMC-7721細(xì)胞凋亡通路相關(guān)蛋白表達的電泳圖（Pro為酶原型蛋白；Cleaved為剪切型蛋白；PARP為聚二磷酸腺苷-核糖聚合酶；Caspase-3為半胱天冬酶3；Caspase-7為半胱天冬酶7）

2.4 3組SMMC-7721細(xì)胞Bcl-2家族蛋白表達水平比較 與siCtrl組比較，SMMC-7721細(xì)胞siMTHFD2#1組和siMTHFD2#2組中Puma表達水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.01），3 組 Bim、Bid、Bad、Bik、Bak、Bax表達水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表 5、圖4。

圖4 3組SMMC-7721細(xì)胞Bcl-2家族蛋白表達的電泳圖（Bcl-2為B淋巴細(xì)胞瘤-2；Puma為p53正向凋亡調(diào)節(jié)因子；Bim為BH3交叉域互作介導(dǎo)蛋白；Bid為BH3交叉域死亡受體激動蛋白；Bad為BH3關(guān)聯(lián)死亡啟動子；Bik為BH3交叉域互作殺傷蛋白；Bak為BH3關(guān)聯(lián)K蛋白；Bax為BH3關(guān)聯(lián)X蛋白）

表5 3組SMMC-7721細(xì)胞Bcl-2家族蛋白表達水平比較

2.5 4組SMMC-7721細(xì)胞增殖能力比較 在96 h的時間點，siMTHFD2組OD值低于siNC組，而siMTHFD2+siPuma組的OD值則明顯高于siMTHFD2組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.01），見表 6、圖 5。

圖5 4組SMMC-7721細(xì)胞增殖能力比較（OD為光密度）

表6 4組SMMC-7721細(xì)胞增殖能力比較

2.6 4組SMMC-7721細(xì)胞凋亡率比較 siMTHFD2組凋亡率高于siNC組，siMTHFD2+siPuma組則明顯低于siMTHFD2組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見表7、圖 6。

圖6 4組SMMC-7721細(xì)胞凋亡率的流式細(xì)胞圖

表7 4組SMMC-7721細(xì)胞凋亡率比較（%）

3 討論

MTHFD2作為線粒體葉酸循壞代謝中的關(guān)鍵酶，目前在結(jié)腸癌、肺癌、膠質(zhì)瘤等癌癥中均有其關(guān)于細(xì)胞增殖、凋亡、耐藥等方面的研究，但目前對HCC細(xì)胞凋亡過程中MTHFD2功能及調(diào)控機制的探討仍是空白[11-12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲低MTHFD2表達后人HCC細(xì)胞HepG2和SMMC-7721都呈現(xiàn)出明顯的凋亡表型，細(xì)胞凋亡關(guān)鍵因子Cleaved PARP、Cleaved Caspase-7、Cleaved Caspase-3的表達均被激活，表明敲低MTHFD2表達能促進HCC細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞的程序化死亡進程，Bcl-2蛋白家族與p53蛋白是多數(shù)細(xì)胞中重要的凋亡調(diào)節(jié)因子。Puma屬于Bcl-2蛋白家族BH3亞族，是p53誘導(dǎo)細(xì)胞進入凋亡過程中的關(guān)鍵下游蛋白，介導(dǎo)由線粒體細(xì)胞色素C釋放所激活的內(nèi)源性凋亡途徑。有研究表明激活p53-Puma-BAX/Bcl-2通路將導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌凋亡并抑制細(xì)胞生長[13]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，敲低MTHFD2表達后HCC細(xì)胞的Puma表達水平明顯上升，進一步將Puma表達下調(diào)后，MTHFD2敲低所導(dǎo)致的促凋亡現(xiàn)象被明顯抑制，在分子水平上揭示MTHFD2是通過調(diào)控Puma表達從而促進HCC細(xì)胞凋亡。這可能是由于腫瘤細(xì)胞自身的代謝特性使其長時間處于高濃度活性氧的環(huán)境中，當(dāng)活性氧劑量增加則會進一步激活p53蛋白，從而抑制細(xì)胞周期，啟動凋亡進程[14]。而MTHFD2能通過平衡葉酸代謝中的氧化還原反應(yīng)降低活性氧含量，從而抑制了p53-Puma信號軸，最終阻斷腫瘤細(xì)胞的凋亡進程[15]。

由于HCC早期診斷、治療和相關(guān)基礎(chǔ)研究的發(fā)展，其術(shù)后生存率已有一定提高，但HCC的整體治療效果仍較差，因此尋找能夠有效阻滯腫瘤細(xì)胞惡性進程，進而提高HCC患者生存率的分子靶標(biāo)也成為了亟待解決的臨床研究課題。Pikman等[16]的研究小組在急性髓系白血?。ˋML）中的研究中表明，靶向MTHFD2能夠抑制AML細(xì)胞生長和集落形成，延長患者生存期。Kawai等[17]研究結(jié)果報道，口服的MTHFD2抑制劑DS18561882能夠在小鼠乳腺癌細(xì)胞異體移植模型中有效抑制腫瘤的生長。而本研究揭示，MTHFD2敲低后能夠通過下游分子Puma誘導(dǎo)HCC細(xì)胞進入凋亡程序，這一研究結(jié)果表明MTHFD2具有成為治療HCC有效分子靶標(biāo)的潛在臨床應(yīng)用價值。在后續(xù)的研究中，本研究團隊將在動物水平和臨床樣本兩方面進行進一步論證，充分解析MTHFD2在HCC中的功能及相關(guān)分子機制。

綜上所述，敲低MTHFD2的表達能夠促進HCC細(xì)胞凋亡，這可能是通過上調(diào)Puma的表達水平來實現(xiàn)的。提示MTHFD2可作為靶點進而應(yīng)用于臨床HCC治療，為腫瘤患者的臨床治療研究開辟了新的方向。