左力翔，牛 艷，安曉寧，高 磊，秦國(guó)杰

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太原030031）

核桃青皮占果實(shí)質(zhì)量的1/2 以上，含有大量生物活性物質(zhì)。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究集中于開(kāi)發(fā)這些活性物質(zhì)的生物化學(xué)功能，為提升核桃青皮資源價(jià)值提供更多潛能。有研究指出，核桃青皮提取物對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲具有明顯抑制作用[1]；NH2SO3H 溶液中加入核桃青皮提取物對(duì)冷軋鋼具有緩蝕作用[2]；產(chǎn)蛋后期添加核桃青皮提取物可維持蛋雞的產(chǎn)蛋性能[3]；5%的核桃青皮乙醇提取物不僅對(duì)無(wú)花果果實(shí)具有保鮮效果，且無(wú)花果果實(shí)的品質(zhì)和風(fēng)味均能得到較好的保持[4]。除此之外，核桃青皮還應(yīng)用于生物有機(jī)肥、殺蟲(chóng)滅菌劑、染色劑及天然食用色素等很多方面[5-9]。這些研究結(jié)果為核桃青皮高值利用提供了大量實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和理論依據(jù)。

新形勢(shì)下，核桃產(chǎn)業(yè)已發(fā)展成為宜栽區(qū)農(nóng)民脫貧增收的主要致富產(chǎn)業(yè)[10-11]。發(fā)展核桃青皮高值利用產(chǎn)業(yè)對(duì)改善農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境、提高核桃產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。核桃青皮中的醌類(lèi)、酚類(lèi)以及多糖是核桃青皮最主要的3 種活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、殺蟲(chóng)、化感作用等[12-14]。目前對(duì)于核桃青皮主要活性物質(zhì)的研究大多集中在提取、功能和應(yīng)用方面[15-19]，對(duì)于何時(shí)收獲可以最有效地獲取此類(lèi)物質(zhì)的研究較少。楊漓等[20]研究了不同核桃品種核桃青皮中胡桃醌含量的變化規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，核桃青皮中胡桃醌含量在7 月下旬到8 月初達(dá)到峰值，然后隨著果實(shí)成熟逐漸下降。王紅霞等[21]通過(guò)對(duì)6 種核桃青皮多糖含量變化規(guī)律的研究發(fā)現(xiàn)，果殼硬化期核桃青皮多糖含量最高，果實(shí)速長(zhǎng)期次之，成熟期最低。SHI 等[22]對(duì)核桃青皮中酚類(lèi)物質(zhì)的季節(jié)變化規(guī)律研究發(fā)現(xiàn)，8 月下旬酚類(lèi)物質(zhì)含量開(kāi)始下降。以上研究分別討論了不同地區(qū)單種功能成分的季節(jié)變化規(guī)律。但目前依然沒(méi)有同時(shí)分析核桃生育期青皮中醌類(lèi)、酚類(lèi)和多糖的變化規(guī)律的研究，且山西省本地核桃品種青皮中功能成分的季節(jié)變化規(guī)律尚未開(kāi)展相關(guān)研究。

為提高核桃青皮功能成分的利用效率，本研究以山西省汾陽(yáng)核桃主產(chǎn)區(qū)主栽品種晉龍1 號(hào)為材料，研究了不同生長(zhǎng)時(shí)期核桃青皮中的醌類(lèi)、酚類(lèi)及多糖含量的變化規(guī)律，旨在為核桃青皮功能成分的高值利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

2019 年 6 月 15 日至 9 月 15 日，每隔 15 d 分別采集山西省汾陽(yáng)市威雄經(jīng)濟(jì)林合作社優(yōu)種核桃苗木繁育基地的晉龍1 號(hào)（樹(shù)齡20 a）核桃，將核桃青皮50 ℃條件下烘干，粉碎、封裝后保存于冰箱（4 ℃）備用。

1.2 試劑及儀器

無(wú)水乙醇，丙酮，乙醚，福林- 酚，碳酸鈉，沒(méi)食子酸，苯酚，濃硫酸，葡萄糖，冰乙酸，氫氧化鈉，氨水，胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)品，所有試劑藥品均為分析純，并不做其他任何二次處理。去離子水通過(guò)電阻率為18.2 Ω/cm 的ELGA PURELAB 超純水設(shè)備制得。

恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司），超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司，KQ5200DE），紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（安捷倫，Cary8454），超高效液相色譜儀（島津，LC-30）。

1.3 高效液相色譜鑒定核桃青皮內(nèi)物質(zhì)種類(lèi)

稱(chēng)取0.500 0 g核桃青皮樣品，加入5 mL 甲醇∶水＝1∶1（體積比），浸泡 4 h，隨后 40 ℃超聲處理40 min；然后于 4 ℃下 12 000 r/min 離心 10 min，取5 μL 上清液進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)。

色譜條件：色譜柱為Waters HILIC BEH Column（100 mm×3 mm，1.7 μm），流速為 0.300 mL/min，柱溫為35 ℃。流動(dòng)相A 為乙腈（acetonitrile），流動(dòng)相B 為0.1%乙酸（CH3COOH-H2O）。具體流動(dòng)相比例及其時(shí)間為：流動(dòng)相A 5%、流動(dòng)相B 95%，0 min；流動(dòng)相A 50%、流動(dòng)相B 50%，10 min；流動(dòng)相A 95%、流動(dòng)相B 5%，13 min；流動(dòng)相A 5%、流動(dòng)相B 95%，14 min；流動(dòng)相A 5%、流動(dòng)相B 95%，16 min。

1.4 總醌含量的測(cè)定

根據(jù)報(bào)道方法并做相應(yīng)調(diào)整測(cè)量總醌含量[23]。將核桃青皮樣本過(guò)0.425 mm 篩之后，稱(chēng)取約0.025 0 g，加入6 mL 混合酸（25%鹽酸∶冰乙酸＝2∶18（體積比）），沸水浴回流15 min，冷卻至室溫，加入8 mL 乙醚洗滌殘?jiān)〕錾锨逡?，重?fù)洗滌3 次，每次6 mL，將3 次得到的上清液樣品合并于分液漏斗中。在分液漏斗中先加入20 mL 的混合堿（10%氫氧化鈉∶4%氨水＝1∶1（體積比））進(jìn)行萃取，取出下層溶液，重復(fù)萃取3 次至乙醚層無(wú)色，合并3 次萃取得到的下層溶液，放置30 min，同時(shí)以混合堿為空白于525 nm 處檢測(cè)吸光度。重復(fù)3 次。

1.5 總酚含量的測(cè)定

研究采用福林- 酚法測(cè)定樣品中總酚含量[24-25]。將核桃青皮樣品過(guò)0.425 mm 篩之后，稱(chēng)取約0.025 0 g，加入1 mL 60%乙醇提取液，先在60 ℃水浴處理10 min，然后超聲處理30 min，最后于12 000 r/min 離心10 min，待測(cè)。重復(fù)3 次。

1.6 多糖含量的測(cè)定

采用苯酚- 硫酸法檢測(cè)多糖[26]。將樣本過(guò)0.425 mm篩，稱(chēng)取約0.025 0 g，加入6 mL 二次水并用封口膜封蓋，之后沸水浴5 min，然后離心10 min（4 000 r/min，25 ℃）。離心結(jié)束后取 200 μL 上清液加入95%乙醇，靜置過(guò)夜。最后，將靜置后的溶液離心10 min（12 000 r/min）并去除上清液，沉淀分別用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚各洗滌2 次，再加入6 mL 去離子水振蕩至溶解，隨后稀釋10 倍，待測(cè)。重復(fù)3 次。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

總醌標(biāo)準(zhǔn)曲線以胡桃醌為標(biāo)準(zhǔn)品，分別配制180、120、60、12、6、0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在 525 nm處測(cè)量其吸光度值。總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，分別配制 124、62、31、15、7.5 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在760 nm 處測(cè)量其吸光度值。多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，分別配制 100、80、60、40、20、0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在490 nm 處測(cè)量其吸光度值。

1.8 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 和Origin Pro 8.5 進(jìn)行處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果

從圖1 可以看出，總醌標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝0.007 8x－0.013 2（R2＝0.999 8）?？偡訕?biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝0.004 4x－0.008 3（R2＝0.999 8）。多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝0.003 2x－0.006 5（R2＝0.996 5）。結(jié)果表明，在各自相應(yīng)的檢測(cè)范圍內(nèi)各標(biāo)準(zhǔn)品濃度與吸光度值具有良好的線性關(guān)系，可用于檢測(cè)核桃青皮內(nèi)總醌、總酚以及多糖的含量。

2.2 核桃青皮生物活性物質(zhì)種類(lèi)鑒定分析

為確定核桃青皮含有的生物活性物質(zhì)的種類(lèi)，采用高效液相色譜對(duì)核桃青皮進(jìn)行鑒定分析。從圖2 可以看出，通過(guò)鑒定發(fā)現(xiàn)，該核桃青皮樣品內(nèi)共有107 種各類(lèi)活性物質(zhì)。其中，酚類(lèi)主要包括黃岑素、兒茶素、飛燕草素、花旗松素、楊梅素、柚皮素、刺槐黃素、黃豆苷等在內(nèi)的黃酮類(lèi)，包括沒(méi)食子酸、綠原酸、阿魏酸、丁香酸、咖啡酸、鞣花酸、斛皮素、胡桃醌等在內(nèi)的單體酚酸，以及水解單寧。醌類(lèi)物質(zhì)主要包括胡桃醌、羥基茜草素、1，4- 萘二酮、2，5- 二甲氧基苯醌、核桃酮等。糖和糖苷包括D 蘇糖、番石榴苷、葡萄糖苷、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖等。除此之外，還包括氨基酸（纈氨酸、丙氨酸、瓜氨酸、蛋氨酸、胱氨酸等）、有機(jī)酸（烏頭酸、尿酸、富馬酸、琥珀酸、蘇糖酸、龍膽酸、壬二酸、檸檬酸、酒石酸、粘酸、亞油酸、亞麻酸、反式?；撬岬龋⑸飰A（葫蘆巴堿、禾草堿、膽堿、D- 肉堿、磷酸膽堿、毛果蕓香堿、胡椒堿等）、維生素（生物素、維生素B5等）、其他結(jié)構(gòu)的生物活性物質(zhì)（黃豆苷、科羅索酸、異櫻草苷7-O- 新橙皮苷、苯并噻唑等）和一些鹽如葡萄糖酸鹽等。其中，酚類(lèi)物質(zhì)達(dá)19 種之多，醌類(lèi)物質(zhì)雖然種類(lèi)比較少，但是單種成分含量較高。鄭曉寧等[27]研究表明，胡桃醌在核桃青皮中的含量最高。此外，樣品中的多糖含量也較為豐富，共檢測(cè)到6 種主要單糖成分，與謝東雪等[19]對(duì)多糖分離純化的研究結(jié)果類(lèi)似。如此豐富的活性物質(zhì)使核桃青皮具有抗菌、抗氧化、抗突變、抗腫瘤、抗真菌、殺幼蟲(chóng)、防腐等一系列功能。如表1 中列舉的具有抗菌、抗氧化、抗突變作用的香豆酸；具有抗腫瘤、抗真菌、殺幼蟲(chóng)作用的香豆素；對(duì)金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、大腸桿菌及綠膿桿菌均有不同程度抑制作用的對(duì)香豆酸；具有消炎、抗?jié)B出、增加靜脈張力、改善血液循環(huán)以及糾正腦功能失常等作用的七葉皂苷；具有抗菌消炎、清除自由基的柚皮素；具有抗真菌和抗腫瘤的鷹嘴豆素A；具有抗菌、抗病毒的綠原酸；用于抗病毒、殺菌劑、抗氧化劑、殺蟲(chóng)增效劑的芝麻素以及可用作食品防腐劑的壬二酸等。這些功能成分表明，核桃青皮作為一種農(nóng)業(yè)資源具有巨大發(fā)展?jié)摿?。因此，本研究基于此結(jié)果檢測(cè)此3 類(lèi)物質(zhì)的總量，并研究果實(shí)發(fā)育過(guò)程中此3 類(lèi)物質(zhì)在核桃青皮內(nèi)含量的變化規(guī)律。

表1 核桃青皮中部分生物活性物質(zhì)

2.3 核桃青皮內(nèi)總醌、 總酚及其多糖含量的生長(zhǎng)期變化規(guī)律

不同產(chǎn)地、品種核桃所經(jīng)歷的果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間不同，大體經(jīng)歷緩慢生長(zhǎng)期、快速膨大期、硬核期和種仁成熟期[28]。本試驗(yàn)研究了從快速膨大中期（6 月15 日）到種仁成熟期（9 月15 日）核桃青皮中總醌、總酚及其多糖的變化規(guī)律。由圖3 可知，6 月15 日總醌含量相對(duì)較低，約53.36 mg/100 g，且增長(zhǎng)速率較慢，到7 月1 日僅增長(zhǎng)至55.36 mg/100 g，進(jìn)入7 月以后總醌含量不斷增加并在7 月30 日達(dá)到最高，為77.36 mg/100 g，之后逐漸降低并且降低的速率逐漸增加，到9 月15 日達(dá)到最低，為36.76 mg/100 g。

由圖4 可知，核桃青皮內(nèi)總酚含量的變化規(guī)律同總醌類(lèi)似，開(kāi)始階段均保持較低的含量和增長(zhǎng)率，從6 月15 日到 7 月 1 日僅增加2 mg/100 g。進(jìn)入7 月后含量迅速積累，并在7 月上旬增速最大，8 月15 日達(dá)到最大，為50.64 mg/100 g，比總醌稍有滯后，然后含量迅速降低，最終在種仁成熟階段達(dá)到最低，為18.97 mg/100 g。

由圖5 可知，多糖含量的變化規(guī)律也呈現(xiàn)先增后減的變化趨勢(shì)，但是整體趨勢(shì)提前，在7 月15 日達(dá)到最高，為212.23 mg/100 g，后開(kāi)始逐漸降低，同樣在種仁成熟期達(dá)到最低，為86.82 mg/100 g。

3 結(jié)論與討論

對(duì)比3 種物質(zhì)含量的變化趨勢(shì)可以發(fā)現(xiàn)，從6 月15 日開(kāi)始3 種物質(zhì)增長(zhǎng)速率都相對(duì)緩慢，這可能是由于核桃快速膨大期的光合同化產(chǎn)物及其礦質(zhì)元素主要用于核桃的生長(zhǎng)[29]，同時(shí)該階段果實(shí)增長(zhǎng)速率很快，抵消了部分醌類(lèi)、多酚及多糖的積累速率，使其表現(xiàn)出來(lái)的單位質(zhì)量?jī)?nèi)的增量不大[22]。當(dāng)核桃生長(zhǎng)至硬殼期，核桃個(gè)體生長(zhǎng)緩慢，同時(shí)醌類(lèi)、多酚、多糖等物質(zhì)合成速度加快，因此，表現(xiàn)出各種成分的含量急劇上升。此外，有研究表明，該時(shí)期各種功能性成分的增多有利于核桃緩解此時(shí)高溫、高輻射等不利條件帶來(lái)的環(huán)境壓力[30]。當(dāng)核桃生長(zhǎng)至種仁成熟期，此時(shí)的生長(zhǎng)中心轉(zhuǎn)移至核桃仁，大量的能量用于合成核桃仁內(nèi)的蛋白質(zhì)和脂肪，因此，核桃青皮內(nèi)的各種功能成分含量開(kāi)始下降。此外，當(dāng)核桃成熟之后核桃青皮表面會(huì)產(chǎn)生裂痕，加速醌類(lèi)和酚類(lèi)物質(zhì)的氧化，使其含量加速下降。對(duì)于多糖而言，不僅在果實(shí)膨大期需要大量的糖分，在果殼硬化期為了給果仁成熟期的發(fā)育做準(zhǔn)備，也需要大量糖分的積累。因此，糖分等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累非常迅速，從而更早達(dá)到最高值；當(dāng)核桃進(jìn)入種仁成熟期，核桃青皮中包括鉀在內(nèi)的各種元素增多，促進(jìn)糖分的加速轉(zhuǎn)化，因此，多糖含量最低。

根據(jù)本研究結(jié)果，可以將快速膨大中期（6 月15 日）到種仁成熟期（9 月15 日）的核桃青皮內(nèi)功能成分的積累大致分為4 個(gè)階段。第1 個(gè)階段為緩慢增長(zhǎng)期，第2 個(gè)階段為快速增長(zhǎng)期，第3 個(gè)階段為穩(wěn)定期積累期，第4 個(gè)階段為快速消耗期。醌類(lèi)、多酚和多糖3 類(lèi)物質(zhì)在具體變化節(jié)點(diǎn)上存在差異，但都經(jīng)歷上述4 個(gè)階段。如：本研究中總醌含量在7 月30 日達(dá)到最大，這與楊漓等[20]的研究結(jié)果類(lèi)似，該研究認(rèn)為核桃青皮中胡桃醌的含量在7 月下旬到8 月初達(dá)到峰值，然后隨著果實(shí)成熟呈下降趨勢(shì)。SHI 等[22]研究了不同發(fā)育階段（4 月 25 日至 9 月19 日）核桃青皮酚類(lèi)物質(zhì)含量及抗氧化活性的變化規(guī)律，結(jié)果表明，總酚含量在快速膨大期出現(xiàn)了下降，硬殼期呈上升趨勢(shì)直到8 月初達(dá)到最高，之后呈下降趨勢(shì)，完全成熟后達(dá)到最低值。本研究中總酚含量在8 月15 達(dá)到最高，之后快速下降并在成熟期達(dá)到最低，與其研究結(jié)果類(lèi)似。同樣，本研究中多糖含量在果殼硬化期達(dá)到峰值，與王紅霞等[21]的研究結(jié)果一致，其含量的變化規(guī)律和進(jìn)程具有相似性。

本研究討論了核桃青皮功能成分變化規(guī)律同核桃仁生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律之間的關(guān)系。由于核桃的生長(zhǎng)發(fā)育是以核桃仁為核心，核桃青皮中各種營(yíng)養(yǎng)及其功能成分的變化規(guī)律應(yīng)與核桃仁的發(fā)育進(jìn)程具有相關(guān)性。因此，今后應(yīng)進(jìn)一步研究核桃青皮中功能成分的轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)化規(guī)律，為揭示核桃青皮與核桃仁中各種營(yíng)養(yǎng)成分在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的關(guān)系等方面具有重要啟示。