蔣公建，魏世軍，駱世軍，雷元軍，范建彪，艾笑揚(yáng)，符華林*

（1.重慶市萬(wàn)州區(qū)畜牧技術(shù)推廣站，重慶 萬(wàn)州 404100；2.重慶市開州區(qū)畜牧獸醫(yī)局，重慶 開州 405400；3.重慶先鋒動(dòng)物藥業(yè)有限公司，重慶 萬(wàn)州 404100；4.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸藥創(chuàng)新制劑工程技術(shù)研究中心，四川 成都 611130）

氟苯尼考是動(dòng)物專用的抗生素，在獸醫(yī)臨床中應(yīng)用較廣泛［1］，但隨著細(xì)菌耐藥性的不斷出現(xiàn)，氟苯尼考須大劑量使用才能在臨床上達(dá)到良好的治療效果，這無(wú)疑增加了該藥的應(yīng)用成本［2］?；前烽g甲氧嘧啶屬于磺胺類的代表藥物之一，在體內(nèi)和體外均有較強(qiáng)的抗菌作用，細(xì)菌雖會(huì)對(duì)此藥產(chǎn)生耐藥性，但速度較慢。本試驗(yàn)旨在探討氟苯尼考與磺胺間甲氧嘧啶聯(lián)合用藥的體外抑菌效果，判斷它們?cè)谂湮楹笫欠窬哂袇f(xié)同或相加作用，為氟苯尼考復(fù)方制劑的研制及其與磺胺間甲氧嘧啶臨床合理配伍提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 藥品與試劑 氟苯尼考，含量99.8%，湖北中牧宏達(dá)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20 180814；磺胺間甲氧嘧啶，含量99.5%，安徽華澳生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20170321。MH 液體培養(yǎng)基、MH瓊脂購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)菌株 大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)研究室提供，系臨床分離致病菌。

2 試驗(yàn)方法

2.1 細(xì)菌的培養(yǎng) 從新鮮培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌平板上分別挑取2～3 個(gè)菌落，每種細(xì)菌分別單獨(dú)接種到2 mL MH肉湯試管中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)6 h后，用計(jì)數(shù)法分別測(cè)定三種菌液的濃度。用生理鹽水稀釋菌液至3.0×108CFU/mL，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫?］。

2.2 抗菌藥物的制備 用分析天平分別稱取氟苯尼考和磺胺間甲氧嘧啶適量，氟苯尼考以純化水超聲溶解并配成100 μg/mL，用0.22 μm無(wú)菌濾膜過濾，置4 ℃冰箱保存?；前烽g甲氧嘧啶用NaOH 液溶解，以純化水定容至6.4 mg/mL，用0.22 μm無(wú)菌濾膜過濾后，置4 ℃冰箱保存［4］。

2.3 抑菌活性的測(cè)定 參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI）藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，采取微量肉湯法測(cè)定每種藥物對(duì)三種細(xì)菌的MIC值［5］。將試驗(yàn)需要的所有器材放入超凈工作臺(tái)用紫外燈照射30 min，將藥液用MH 肉湯二倍稀釋后加入96 孔板第一排的第1～11 孔，每孔加入經(jīng)梯度稀釋的不同濃度藥液100 μL，MH肉湯90 μL，菌液10 μL（使得每孔細(xì)菌終濃度為1×105～2×105CFU/mL），第12 孔作為陽(yáng)性對(duì)照。前三排為對(duì)照重復(fù)樣本。第四排作為藥物陰性對(duì)照，只加入對(duì)應(yīng)藥液濃度的藥液100 μL，MH 肉湯90 μL，生理鹽水10 μL。第五排作為培養(yǎng)基陰性對(duì)照，每孔加入生理鹽水110 μL，MH 肉湯90 μL。將加好試液的96孔板放置于漩渦震蕩儀上，混勻后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h，然后觀察結(jié)果［6］。肉眼觀察96 孔板每一行中渾濁孔前的澄清孔的藥液終濃度，以此作為MIC 值。按此方法測(cè)定兩種藥物對(duì)三種細(xì)菌的抑菌活性。完全按照上述程序進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)1 次，當(dāng)MIC 值能準(zhǔn)確重復(fù)或差1 個(gè)濃度梯度時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果即為有效。

2.4 氟苯尼考與磺胺間甲氧嘧啶聯(lián)合應(yīng)用的藥敏試驗(yàn) 采用肉湯稀釋棋盤法［7］測(cè)定氟苯尼考與磺胺間甲氧嘧啶體外聯(lián)用的抗菌活性。將已經(jīng)測(cè)定好MIC 值的氟苯尼考與磺胺間甲氧嘧啶組合，在96 孔板的A～F 行沿橫軸方向（從左往右）依次加入終濃度為MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC的氟苯尼考藥液50 μL，以同樣的方法在第1～6 列沿豎軸方向（從上到下）依次加入終濃度為MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC的磺胺間甲氧嘧啶藥液50 μL，然后每孔加入MH肉湯90 μL，菌液10 μL（使得每孔終濃度為1×105～2×105CFU/mL）。第七排的第1、2、3 孔只加入MH 肉湯100 μL，第八排的第1、2、3孔只加入生理鹽水100 μL。將加好試液的96孔板放置于漩渦震蕩儀上，混勻后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h，然后觀察結(jié)果并計(jì)算澄清孔的FIC值。完全按上述程序重復(fù)3次。

2.5 聯(lián)合效應(yīng)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 試驗(yàn)結(jié)果以部分抑菌濃度（FIC）指數(shù)作為聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的判斷依據(jù)［8］：

當(dāng)FIC指數(shù)≤0.5時(shí)，判斷二者為協(xié)同作用；當(dāng)0.5＜FIC 指數(shù)≤1 時(shí)，判斷二者為相加作用；當(dāng)1＜FIC 指數(shù)≤2 時(shí)，判斷二者為無(wú)關(guān)作用；當(dāng)FIC指數(shù)＞2時(shí)，判斷二者為拮抗作用。

3 結(jié)果與分析

3.1 藥物單用時(shí)的MIC 測(cè)定結(jié)果 氟苯尼考單用對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌的MIC均為5 μg/mL，結(jié)果與吳碩文等［7］的研究結(jié)果相符。磺胺間甲氧嘧啶單用對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的MIC 均為160 μg/mL，該結(jié)果與郭永剛等［9］的研究結(jié)果相符。

3.2 聯(lián)合用藥的測(cè)定結(jié)果 氟苯尼考與磺胺間甲氧嘧啶聯(lián)合用藥對(duì)三種細(xì)菌的FIC值測(cè)定結(jié)果如表1～表3所示。由表可知，氟苯尼考與磺胺間甲氧嘧啶配伍使用對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌的MIC均有所下降，表明二者聯(lián)用后抗菌活性有所加強(qiáng)。

表1 氟苯尼考與磺胺間甲氧嘧啶聯(lián)合用藥對(duì)大腸桿菌FIC值的測(cè)定

表2 氟苯尼考與磺胺間甲氧嘧啶聯(lián)合用藥對(duì)沙門氏菌FIC值的測(cè)定

表3 氟苯尼考與磺胺間甲氧嘧啶聯(lián)合用藥對(duì)金黃色葡萄球菌FIC值的測(cè)定

兩藥單用與聯(lián)合應(yīng)用的抑菌效果如表4 所示。磺胺間甲氧嘧啶與氟苯尼考聯(lián)用時(shí)，磺胺間甲氧嘧啶的MIC 比單用時(shí)減少到1/32～1/2，氟苯尼考的MIC 比單用時(shí)減少了1/2。說明二者配伍使用可有效降低藥物的使用量，二者聯(lián)合用藥對(duì)三株細(xì)菌的部分抑菌濃度（FIC）指數(shù)大于0.5且≤1，可見二者聯(lián)用表現(xiàn)為相加作用。

表4 氟苯尼考與磺胺間甲氧嘧啶單用及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)三種菌的抑菌結(jié)果

4 分析討論

4.1 聯(lián)合用藥的抗菌機(jī)理分析 氟苯尼考與磺胺間甲氧嘧啶分別對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌有一定的抑制作用。二者聯(lián)用產(chǎn)生相加作用可能是因?yàn)榉侥峥寂c磺胺間甲氧嘧啶的作用靶點(diǎn)不同所致，其作用機(jī)理可能為：氟苯尼考抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，而磺胺間甲氧嘧啶可以抑制細(xì)菌DNA的合成，如果將兩者以適當(dāng)比例配伍則可從兩方面抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，增強(qiáng)其抗菌效果。

4.2 聯(lián)合用藥的合理性討論 聯(lián)合用藥可以打破不同藥物藥效作用不足帶來(lái)的限制，充分發(fā)揮協(xié)同作用，減少藥物的用量，從而有效地控制成本。藥物在聯(lián)合使用時(shí)會(huì)互相影響而使療效及不良反應(yīng)發(fā)生變化。合理的聯(lián)合用藥能增強(qiáng)療效，減少不良反應(yīng)，避免或延緩耐藥性產(chǎn)生，延長(zhǎng)療程，這是控制抗生素大量使用的重要方法。

本試驗(yàn)雖從體外抗菌效應(yīng)的角度驗(yàn)證了兩者可組方使用，但未就其配伍穩(wěn)定性、體內(nèi)毒性等方面進(jìn)行驗(yàn)證，還需待進(jìn)一步探究。