應(yīng)俊杰* 李世平 屈藝 母得志

（四川大學(xué)華西第二醫(yī)院兒科/出生缺陷與相關(guān)婦兒疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041）

早產(chǎn)兒是指出生時(shí)胎齡37周以內(nèi)的新生兒，各器官系統(tǒng)發(fā)育尚不完善，并發(fā)癥發(fā)生率和死亡率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于足月兒。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全世界范圍內(nèi)每年大約有1500萬早產(chǎn)兒（約占新生兒的十分之一）。其中，中國早產(chǎn)兒數(shù)量居世界第二，高達(dá)117萬多人，僅次于印度[1]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，早產(chǎn)是5歲以內(nèi)兒童死亡的主要原因，約占新生兒死亡的三分之一[2,3]。近年來，隨著早產(chǎn)兒護(hù)理以及新生兒重癥監(jiān)護(hù)診療技術(shù)的革新，大大提升了早產(chǎn)兒以及極低體重早產(chǎn)兒（<1.5 kg）的存活率，但慢性神經(jīng)功能障礙的早產(chǎn)兒比例也隨之上升[4]。在存活的早產(chǎn)兒中，約有10%患兒具有明顯的永久性運(yùn)動(dòng)功能障礙[5,6]。不僅如此，約25%~50%的早產(chǎn)兒神經(jīng)發(fā)育受到影響，具體表現(xiàn)為認(rèn)知和社會(huì)行為障礙，以及注意力和學(xué)習(xí)障礙，甚至5%~10%的早產(chǎn)兒出現(xiàn)腦癱，嚴(yán)重影響了患兒以及家庭的生活，也給社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)[7-9]。

早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷（Preterm white matter injury，PWMI）是一種嚴(yán)重的新生兒腦損傷，會(huì)造成患兒神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，如腦癱、視聽功能異常、認(rèn)知障礙等，目前臨床上尚缺乏有效的治療手段[7]。PWMI又可分為兩種類別：腦室周圍白質(zhì)軟化（Periventricular leukomalacia，PVL）和彌漫性白質(zhì)損傷（Diffuse white matter injury，dWMI）。PVL多見于早產(chǎn)兒缺血缺氧性腦實(shí)質(zhì)損傷，會(huì)引起腦室周圍白質(zhì)軟化，少突膠質(zhì)細(xì)胞受損，具體表現(xiàn)為局灶性腦白質(zhì)損傷（Punctate white matter damage，PWMD），通過顱腦超聲、CT、MRI等可直接觀察到腦白質(zhì)損傷影像學(xué)改變[10,11]。dWMI的發(fā)生則更為隱蔽，主要因腦白質(zhì)微環(huán)境的改變，導(dǎo)致整個(gè)腦部的髓鞘形成受阻[12,13]。目前研究發(fā)現(xiàn)，約有80%PWMI都是以dWMI形式發(fā)生[13]。然而無論是PVL還是dWMI，目前都沒有有效的治療方案。近年來，干細(xì)胞移植已被應(yīng)用于腎臟、心臟等多種器官損傷修復(fù)中，治療效果顯著[14,15]。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中，干細(xì)胞治療也逐漸開展，迄今為止，已有超過200項(xiàng)應(yīng)用各種干細(xì)胞方法治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床研究（Clinicaltrials.gov）登記在案，其中大多數(shù)已在成人多發(fā)性硬化癥、中風(fēng)和脊髓損傷等疾病治療中應(yīng)用。因此，干細(xì)胞移植也有望應(yīng)用于兒童神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療，成為治療PWMI的一種新方法。

本文綜述了近年來PWMI的發(fā)生機(jī)制研究及干細(xì)胞治療PWMI的研究現(xiàn)狀，并分析了干細(xì)胞移植治療PWMI的優(yōu)化策略，旨在為干細(xì)胞治療PWMI的臨床應(yīng)用提供參考。

1 早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷發(fā)生機(jī)制

在PWMI中，髓鞘形成障礙是區(qū)別于其他新生兒腦損傷的重要特征。髓鞘形成障礙主要由少突膠質(zhì)細(xì)胞成熟異常引起。少突膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育通常包括四個(gè)階段：起源于大腦內(nèi)源性干細(xì)胞的神經(jīng)組細(xì)胞（Neural progenitor cells，NPC），發(fā)育為少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞（Oligo-dendrocyte precursor cells，OPCs），當(dāng)其遷移到特定的大腦區(qū)域后，OPCs增殖并分化為未成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞 （Premyelinating oligodendrocytes，pre-OLs），并最終分化為髓鞘化成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞（Myelinating oligo- dendrocyte，MO），直接參與神經(jīng)髓鞘的形成[16]。

WMI 通常發(fā)生于人類胎齡23~32 周，此階段正是OPCs向pre-OLs分化階段[16]，OPCs和pre-OLs對(duì)缺氧缺血（Hypoxia-ischemia，HI）十分敏感，如果胎兒在此階段發(fā)生缺氧缺血，會(huì)嚴(yán)重影響OPCs的分化成熟，引起髓鞘形成減少，最終導(dǎo)致WMI的發(fā)生，見圖1。

2 干細(xì)胞移植治療早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷研究現(xiàn)狀

干細(xì)胞是一類具有多向分化潛能的細(xì)胞，能夠有效修復(fù)組織和器官損傷，并顯著改善微環(huán)境[17,18]。目前研究應(yīng)用的干細(xì)胞通常有間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs）、胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cell，ESCs）等。鑒于PWMI發(fā)生由少突膠質(zhì)細(xì)胞受損或發(fā)育障礙引起，干細(xì)胞移植有望對(duì)損傷的細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)。一方面，干細(xì)胞可以通過多向分化替代損傷的少突膠質(zhì)細(xì)胞，對(duì)腦白質(zhì)進(jìn)行修復(fù)重建；另一方面，干細(xì)胞還能分泌重要的細(xì)胞因子，激活腦白質(zhì)損傷的內(nèi)源性修復(fù)，改善腦白質(zhì)微環(huán)境，促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟[19]。此外，干細(xì)胞的免疫原性較低，尤其是MSCs幾乎沒有免疫排斥的問題出現(xiàn)。MSCs的主要組織相容性復(fù)合體（Major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ類分子表達(dá)水平低，且不表達(dá)MHC-Ⅱ類分子及T細(xì)胞共刺激分子（B7-1、B7-2、CD40、CD40L）等。因此，不易激活宿主T細(xì)胞的免疫反應(yīng)子，從而免于T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）的攻擊[20]。鑒于干細(xì)胞的低免疫原性的特征，干細(xì)胞移植應(yīng)用于臨床的可行性大大增加。

圖1 少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育各階段示意圖

盡管干細(xì)胞移植治療PWMI具有理論的可行性，但干細(xì)胞在PWMI中的再生作用的證據(jù)仍然缺乏，目前尚無用于臨床PWMI治療的報(bào)道。近年來，研究者們?cè)诩?xì)胞水平及動(dòng)物模型中的研究越來越多，并已逐漸涉及到大動(dòng)物WMI模型的研究[21,22]。

2.1 細(xì)胞水平研究

干細(xì)胞移植治療PWMI的細(xì)胞水平研究主要通過干細(xì)胞與OPCs共培養(yǎng)的方式進(jìn)行，以探究干細(xì)胞對(duì)OPCs分化的影響。Zhang等通過設(shè)置直接接觸和非接觸（Transwell）兩種共培養(yǎng)體系研究大鼠MSCs與OPCs共培養(yǎng)中的作用，發(fā)現(xiàn)直接接觸和非接觸共培養(yǎng)的MSCs都能夠顯著促進(jìn)OPCs的分化，說明MSCs通過旁分泌作用間接調(diào)控OPCs分化[23]。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)直接接觸共培養(yǎng)體系中成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞比例更高，表明除了旁分泌作用，MSCs 對(duì)OPCs的調(diào)控可能還存在其他途徑。例如，在氧化應(yīng)激后，MSCs能夠通過微泡、縫隙連接或納米管將線粒體轉(zhuǎn)移到線粒體功能受損的細(xì)胞[24,25]，提示MSCs對(duì)OPCs等細(xì)胞的作用可能更為豐富，其機(jī)制值得進(jìn)一步探索。除OPCs以外，NSCs也具備分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞的潛能，因而也有研究通過大鼠NSCs與MSCs共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)MSCs也會(huì)促進(jìn)NSCs分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞[26]。

2.2 動(dòng)物模型研究

大鼠是經(jīng)典的WMI模型動(dòng)物，廣泛應(yīng)用于國內(nèi)外WMI臨床前研究中。在PVL建模后1天，向新生大鼠單側(cè)側(cè)腦室注射MSCs，可觀察到MSCs可以遷移到受損的兩個(gè)半球，改善髓鞘形成，提高大鼠的運(yùn)動(dòng)能力[27]。最近的研究還發(fā)現(xiàn)，通過腹腔注射內(nèi)脂多糖誘導(dǎo)出生后4天（P4）大鼠PVL，經(jīng)臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞（Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells，WJ-MSCs）治療后，腦內(nèi)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)顯著降低，并促進(jìn)了MBP的表達(dá)[28]。此外，在dWMI模型的研究中，通過側(cè)腦室注射WJ-MSCs，同樣可以改善大鼠的運(yùn)動(dòng)能力，并促進(jìn)髓鞘形成[29]。動(dòng)物模型中的這些研究證實(shí)了MSCs對(duì)WMI的修復(fù)效果，具有重要的參考意義，但腦室內(nèi)注射的方式缺乏臨床適用性，需對(duì)治療策略進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

3 優(yōu)化干細(xì)胞治療WMI的策略

3.1 干細(xì)胞選擇

選擇合適的干細(xì)胞，是有效應(yīng)用干細(xì)胞移植手段治療PWMI的首要問題。現(xiàn)階段使用成人組織（脂肪組織、外周血、骨髓）和新生兒組織（胎盤和臍帶）來源的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行治療的研究較多，包括：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）、人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（Human amniotic mesenchymal stromal cells，hAMSC）、臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞（Umbilical cord mesenchymal stromal cells，UCMSCs）等[30]。其中胎盤和臍帶來源的MSCs具有較高的增殖和分化能力，并且自體干細(xì)胞移植可以有效規(guī)避免疫原性問題，是干細(xì)胞治療WMI的優(yōu)選之一。此外，由于WMI的受累細(xì)胞是少突膠質(zhì)細(xì)胞，因此，可直接分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞（Neural stem cells，NSCs）和OPCs也被認(rèn)為對(duì)WMI極具治療潛力，國內(nèi)外已有相關(guān)團(tuán)隊(duì)正在開展相關(guān)臨床前研究，但臨床治療效果需要更多研究結(jié)果支持，免疫原性問題也需要進(jìn)一步解決。

3.2 移植途徑選擇

大小鼠WMI模型研究多采用側(cè)腦室注射途徑，手術(shù)創(chuàng)傷較大，難以用于臨床治療。所以除了干細(xì)胞的選擇，臨床治療途徑也至關(guān)重要。動(dòng)脈或靜脈注射的全身給藥方式，可將干細(xì)胞通過血液循環(huán)運(yùn)送到損傷的腦白質(zhì)，但所需的干細(xì)胞濃度將遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于局部給藥，可行性較低。局部給藥除了腦室內(nèi)注射，腰椎穿刺也是臨床常用的方法之一，能有效地將干細(xì)胞注入腦脊液。但腰椎穿刺手術(shù)同樣會(huì)帶來創(chuàng)傷，并可能引發(fā)相關(guān)并發(fā)癥及術(shù)后感染。此外，鼻腔給藥也是嬰兒和兒童常用的一種給藥途徑，可將干細(xì)胞通過嗅覺神經(jīng)輸送至腦組織，給藥過程無創(chuàng)。

最近的一項(xiàng)研究表明，在dWMI大鼠模型中通過鼻內(nèi)注射WJ-MSCs 可觀察到髓鞘的修復(fù)[31]，表明經(jīng)鼻途徑注射干細(xì)胞能夠有效減輕大鼠腦白質(zhì)的損傷，但相關(guān)臨床研究尚無報(bào)道，其有效性需要更多的研究驗(yàn)證。

3.3 基因工程技術(shù)的應(yīng)用

利用基因工程技術(shù)干預(yù)干細(xì)胞中關(guān)鍵因子表達(dá)，能進(jìn)一步提高干細(xì)胞治療效果。例如成人大腦中動(dòng)脈閉塞疾病中，與單純的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療相比，用過表達(dá)BDNF、GDNF、HIF-1α或IL-10的改良骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療，可有效改善腦功能，減少梗死面積[32,33]。因此，基因工程的應(yīng)用有望為干細(xì)胞治療PWMI提供更有效的新工具。

4 總結(jié)與展望

近年來，隨著對(duì)干細(xì)胞的研究的深入，研究者們對(duì)干細(xì)胞來源、移植途徑、免疫原性等多方面條件進(jìn)行優(yōu)化，干細(xì)胞移植技術(shù)在多種疾病治療中安全性和有效性大大提高。干細(xì)胞移植治療早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷的臨床前研究也有了較大的進(jìn)展，是一種極具潛力的治療方法。