葉 漪， 賀 芬， 王 暉， 曾 清， 梁 娟,

(1.懷化學院生物與食品工程學院， 湖南 懷化 418000；2.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室， 湖南 懷化 418000)

種子萌發(fā)首先是胚根突破胚乳細胞壁，而胚乳細胞壁中存在的甘露聚糖等多聚物對種子萌發(fā)時胚根的伸出有較強的機械阻力[1-2]。Ikuma等[3]認為，種子萌發(fā)前細胞壁的降解有助于胚根的突破。胚乳弱化的概念由此產(chǎn)生。胚乳弱化是指種子萌發(fā)過程中，包圍在胚根外圍的胚乳組織由于細胞壁發(fā)生降解，機械強度下降，從而有助于胚根突破胚乳，完成萌發(fā)過程。研究表明，細胞壁的酶促反應或物理方法處理能有效降低胚乳的機械阻力，對胚根突破胚乳細胞壁，即種子萌發(fā)非常重要[3-6]。如在擬南芥、番茄種子萌發(fā)過程中，內切-β-甘露聚糖酶的活性增加[1,7-8]，而在白菜、水稻種子萌發(fā)過程中，內切-β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶和β-甘露糖苷酶均有不同程度的增加[9-10]。

以往研究各處理對種子萌發(fā)過程中細胞壁降解酶活性的影響，都是在種子完成萌發(fā)后一起進行測定[10-11]，有些種子萌發(fā)快，有些慢，甚至還有少量不萌發(fā)，此時各種子的生理活性差異較大，一起測定不能較準確地反映此時細胞壁降解酶的活性。另外，在研究種子萌發(fā)過程中細胞壁降解酶活性變化時，則是在種子的整個萌發(fā)進程中每隔一定時間多次測量酶活性[12-13]，然而細胞壁降解酶活性測定方法繁瑣、耗時，且測定所用試劑價格昂貴。為進一步闡明細胞壁降解酶活性與種子萌發(fā)的關系，本實驗以萵苣種子為材料，探討內切-β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶和β-甘露糖苷酶活性等三種主要的細胞壁降解酶在種子的不同萌發(fā)階段，即干種子、吸脹種子、狹義萌發(fā)種子和完全萌發(fā)種子中的變化情況，為種子萌發(fā)機理的闡明提供理論依據(jù)，同時也為測定其他種子萌發(fā)過程中酶活性的變化提供一條新的思路。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為上海種都公司提供的萵苣種子，市購，于-20 ℃ 冰箱中保存待用。

1.2 方 法

1.2.1萵苣種子吸水曲線的測定

取萵苣種子100粒于80 ℃烘箱中烘至恒重，計算初始含水量。再取100粒萵苣種子置于墊有2層濾紙的直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，加入5 mL去離子水，置于19 ℃恒溫培養(yǎng)箱中吸脹(前期實驗發(fā)現(xiàn)萵苣種子的最適萌發(fā)溫度為19 ℃)，吸脹時間分別為：0、1、2、4、6、8、10、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48 h。按上述時間吸脹后，用濾紙吸干種子表面水分并稱重，計算含水量(g·g-1干種子)，每次處理3次重復，取平均值。最后以吸脹時間為橫坐標，以種子含水量為縱坐標作吸水曲線。

1.2.2萵苣種子萌發(fā)進程的測定

取100粒萵苣種子置于墊有2層濾紙的直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，加入5 mL去離子水，置于19 ℃恒溫培養(yǎng)箱中萌發(fā)(以下胚軸突破種皮2 mm視為發(fā)芽)，每隔2 h統(tǒng)計種子萌發(fā)情況，設3次重復，然后以萌發(fā)時間為橫坐標，萌發(fā)率為縱坐標繪制萌發(fā)進程曲線。

1.2.3萵苣種子不同萌發(fā)階段的確定

結合吸水曲線與萌發(fā)進程，確定萵苣種子萌發(fā)的四個不同階段，即干種子、吸脹種子、狹義萌發(fā)種子、完全萌發(fā)種子。其中干種子為存于-20 ℃ 冰箱中待用的種子；吸脹種子為置于4 ℃冰箱中吸脹的種子(吸脹時間與狹義萌發(fā)種子處理時間一致)；狹義萌發(fā)種子為置于19 ℃恒溫培養(yǎng)箱中萌發(fā)至1%萌發(fā)率時的種子，即萌發(fā)剛啟動的種子；完全萌發(fā)種子為19 ℃恒溫培養(yǎng)箱中萌發(fā)至48 h的種子(18 h后每隔2 h將萌發(fā)的種子轉移至-20 ℃冰箱保存)，即剛萌發(fā)完成的種子。各不同萌發(fā)階段的萵苣種子均保存于-20 ℃冰箱中用于后續(xù)細胞壁降解酶活性的測定。

1.2.4萵苣種子萌發(fā)過程中細胞壁降解酶活性的測定

取不同萌發(fā)階段的300粒萵苣種子加入緩沖液，在冰上迅速研磨(3 min)，然后離心15 min(4 ℃，12 500 r·min-1)，收集上清液，上清液再次離心15 min(4 ℃，12 500 r·min-1)，該上清液用于α-半乳糖苷酶和內切-β-甘露聚糖酶酶活性的測定。再往含有沉淀的離心管中加入緩沖液，混勻，離心15 min(4 ℃，12 500 r·min-1)，收集上清液，此上清液用于β-甘露糖苷酶的活性測定。

α-半乳糖苷酶和β-甘露糖苷酶活性的測定采用PNPG法[14]。α-半乳糖苷酶和β-甘露糖苷酶分別可催化 p-硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷和4-硝基酚苯酚-β-D-吡喃甘露糖甘水解生成對硝基苯酚，后者在405 nm處有最大吸收峰。酶促反應后分別測定405 nm處的OD值，再用考馬斯亮藍法測定這兩個酶的蛋白含量。酶活力單位為每毫克蛋白每分鐘水解得到多少微摩爾對硝基苯酚(對硝基苯酚與蛋白標準曲線如圖1、2所示)。每個設3次重復，取平均值。

圖1 對硝基苯酚標準曲線

圖2 牛血清蛋白標準曲線

內切-β-甘露聚糖酶活性的測定采用凝膠擴散法[14]。內切-β-甘露聚糖酶能夠水解槐豆膠中的半乳甘露聚糖，形成透明圈，其活性大小與透明圈直徑成正比，酶活力用每毫克蛋白所含的酶活力單位來表示(內切-β-甘露聚糖酶活力標準曲線如圖3所示)。每個處理設3次重復，取平均值。

圖3 內切-β-甘露聚糖酶活力標準曲線

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用Student-Newman-Keulsl(S-N-K，p<0.05)進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 萵苣種子的吸脹曲線

以種子干重為基礎表示含水量。如圖4所示，萵苣種子初始含水量較低，為0.05 g·g-1。萵苣種子萌發(fā)過程中吸水呈現(xiàn)“S型曲線”。在0～6 h內，種子吸水速率快，含水量迅速上升至0.46 g·g-1，該階段吸水主要靠吸脹作用完成。在6～16 h內，萵苣種子處于吸水停滯期，吸水量基本保持恒定，含水量由0.455 g·g-1上升至0.475 g·g-1。在16～48 h內，萵苣種子吸水速率再次上升，但上升較為平緩，含水量由0.48 g·g-1上升至0.63 g·g-1，此階段種子相繼萌發(fā)，其吸水為生命吸水。

圖4 萵苣種子吸水曲線

2.2 萵苣種子的萌發(fā)進程

萵苣種子萌發(fā)進程如圖5所示。萵苣種子在18 h時開始萌發(fā)，隨后萌發(fā)率迅速上升，在36 h時，萌發(fā)率達90.11%，隨后種子萌發(fā)率逐步穩(wěn)定， 48 h時萌發(fā)率達95.11%。種子吸水曲線與萌發(fā)進程的測定為萵苣種子萌發(fā)階段的劃分提供了重要依據(jù)。

圖5 萵苣種子萌發(fā)進程

2.3 不同萌發(fā)活性萵苣種子中細胞壁降解酶活性的變化

在萵苣種子萌發(fā)進程中，細胞壁降解酶活性存在顯著差異(圖6～圖8)。在干種子中，具有一定的α-半乳糖苷酶和 β-甘露糖苷酶活性，但內切-β-甘露聚糖酶活性為0。隨著萌發(fā)進程的推進，吸脹種子、狹義萌發(fā)種子以及完全萌發(fā)種子中α-半乳糖苷酶的活性呈遞增的趨勢，完全萌發(fā)種子中其活性為7.82 μmol·(min·mg)-1；內切-β-甘露聚糖酶活性增加最為顯著，完全萌發(fā)種子中其活性為0.05 nkat·mg-1；而 β-甘露糖苷酶的活性則呈遞減的趨勢，完全萌發(fā)種子中該酶的活性最低。

注：同列不同字母表示處理間差異達5%顯著水平。下同。圖6 萵苣種子不同萌發(fā)階段α-半乳糖苷酶活性變化

圖7 萵苣種子不同萌發(fā)階段內切-β-甘露聚糖酶活性變化

圖8 萵苣種子不同萌發(fā)階段β-甘露糖苷酶活性變化

3 結論與討論

種子的萌發(fā)過程包含了一系列生理生化變化，其中胚根必須要先從胚乳細胞壁中突破，才可能突破種皮。很多植物種子的胚乳細胞壁都含有甘露聚糖，通常情況下它是以半乳甘露聚糖的形式存在，而半乳甘露聚糖對種子萌發(fā)時胚根的伸出具有強的機械阻力。而半乳甘露聚糖的降解需要α-半乳糖苷酶、內切-β-甘露聚糖酶和β-甘露糖苷酶的共同作用[15-16]。其中α-半乳糖苷酶是一種外多糖酶，它能水解切斷半乳糖側鏈和甘露糖骨架之間的α-(1→6)連接；內切-β-甘露聚糖酶是一種內切水解酶，它能將甘露糖的多聚物水解成甘露二糖或甘露三糖；而β-甘露糖苷酶可繼續(xù)水解甘露二糖和甘露三糖成為甘露單糖，同時還可從寡聚甘露糖鏈上水解單個甘露糖殘基。在這3 種酶中，內切-β-甘露聚糖酶較為關鍵[17]，其活性在新收獲的干種子中幾乎檢測不到，但在種子萌發(fā)過程中迅速增加。

本實驗發(fā)現(xiàn)，萵苣干種子、吸脹種子中內切-β-甘露聚糖酶活性為0，狹義萌發(fā)種子活性有所增加，完全萌發(fā)后酶活性最高。α-半乳糖苷酶和β-甘露糖苷酶在干種子中均有一定的活性，隨萌發(fā)進程的推進，內切-β-甘露聚糖酶活性和α-半乳糖苷酶活性不斷增加，但β-甘露糖苷酶活性有所降低。因此，內切-β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的活性與萵苣種子萌發(fā)密切相關。萵苣種子萌發(fā)后內切-β-甘露聚糖酶活性的迅速增加可降解胚乳細胞壁中的甘露聚糖，弱化胚乳，同時為幼苗的生長提供營養(yǎng)物質，從而促進種子萌發(fā)[11,18]。α-半乳糖苷酶則通過降解半乳甘露聚糖的支鏈半乳糖，為種子萌發(fā)的早期提供營養(yǎng)物質[19]。β-甘露糖苷酶活性降低，說明其對萵苣種子萌發(fā)作用小或活性表達不具生理意義[20]。

研究整個萌發(fā)過程中細胞壁降解酶活性的動態(tài)變化能更好地闡明細胞壁降解酶活性與種子萌發(fā)的關系。本實驗選取四個具有典型代表性的階段——干種子、吸脹種子、狹義萌發(fā)種子和完全萌發(fā)種子分別進行酶活性的測定。干種子即為萌發(fā)的起點，狹義萌發(fā)處理種子為即將萌發(fā)的種子，吸脹種子介于兩者之間，完全萌發(fā)種子為萌發(fā)終點。測定這四個階段的細胞壁降解酶活性變化，可較準確、真實地反映種子整個萌發(fā)過程中酶活性的變化，同時還可簡化實驗，節(jié)約藥品。為以后研究種子萌發(fā)過程中酶活性的變化提供了一條新的思路。