陳朝桂，施曉麗*，孫澄慧，許天政，陳 琴，張 蓉

（1.貴州大學動物科學學院，貴州貴陽 550025；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學院草業(yè)科學研究所，貴州貴陽 550006）

氨基葡萄糖（Glucosamine,GlcΝ）是葡萄糖衍生物，廣泛存在于人體、動物和微生物幾乎所有細胞中，可從海洋動植物中提取，為糖蛋白和蛋白聚糖主要成分，也是骨基質(zhì)和關(guān)節(jié)軟骨中蛋白多糖的組成成分[1]。GlcΝ 具有抗菌、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤等作用，呈現(xiàn)出功能多樣性[2-4]；GlcΝ 為治療骨關(guān)節(jié)炎的非處方藥，因其安全可靠，又可作為骨骼營養(yǎng)的功能性食品銷售[2-4]。在GlcΝ防治蛋雞骨質(zhì)疏松癥[5]和提高蛋殼質(zhì)量[6]的研究中發(fā)現(xiàn)，GlcΝ 對骨骼和蛋殼質(zhì)量的改善總是伴隨血鈣的提高，且具有強相關(guān)性，表明血鈣在GlcΝ 對骨鈣代謝中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，而血鈣濃度受腸道鈣吸收、骨鈣動用和腎小管重吸收的調(diào)控[8-9]，但GlcΝ 提高血鈣的途徑尚不清楚。鈣結(jié)合蛋白Cabp-D28k 主要分布于禽類小腸、子宮和腎臟，調(diào)節(jié)Ca2+轉(zhuǎn)運，參與蛋雞對鈣的吸收、代謝及蛋殼形成等過程[10-13]。因此，實驗擬通過研究GlcΝ 對蛋雞飼糧鈣的消化吸收和十二指腸Cabp-D28k基因的表達相關(guān)性分析，揭示GlcΝ 是否通過腸道吸收來調(diào)節(jié)血鈣水平，為蛋雞健康養(yǎng)殖、功能性添加劑的應用和推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 氨基葡萄糖硫酸鹽（純度99.5%，USP 級）購自江蘇日欣生物（高郵，中國）。

1.2 實驗動物與實驗設計 采用2×3 兩因素隨機實驗設計，挑選體重相近（2.0 kg）、產(chǎn)蛋率相近（89%）、30 周齡健康羅曼蛋雞144 只，分成0% GlcΝ（對照組）和0.6% GlcΝ 2 個處理組，每個處理組飼糧鈣設置3 個水平，分別為3.0%、3.2%和3.4%。每小組4 個重復，每重復6 羽蛋雞。預試期4 d 以使內(nèi)源鈣的排泄趨于穩(wěn)定，正試期3 d。

1.3 實驗飼糧及其營養(yǎng)水平 參照中國《雞飼養(yǎng)標準》（ΝY/T33-2004）和《家禽營養(yǎng)需要》（ΝRC，1994），設計含鈣量分別為3.0%、3.2% 和3.4% 的3個玉米-豆粕型基礎飼糧（對照組），實驗組則在各基礎飼糧中分別添加0.6% GlcΝ，飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。其中，各組飼糧中粉鈣和顆粒鈣比例均為1:1。為保證試雞采食均勻，將飼糧制成顆粒料飼喂。

表1 實驗飼糧組成及營養(yǎng)成分(風干基礎)

1.4 飼養(yǎng)管理 蛋雞每籠6 只，按自由采食量的80%（80 g/d）飼喂[14]，自由飲水，光照16 h，溫濕度條件一致。

1.5 代謝實驗 借鑒差量法[15-17]和回歸法[16-17]測定飼糧中鈣的表觀和真代謝率。全收糞法收集飼糧和糞[17]，準確記錄采食量，去除糞上羽毛皮屑，收集糞便3 d，按5 mL/100 g 鮮糞比例加入10% 鹽酸固氮，置于4℃保存，待實驗結(jié)束，按重復將糞樣混合均勻，10%比例取樣，置于60℃烘箱中烘至恒重，粉碎過40 目篩后用于鈣含量測定。

1.6 樣品采集及指標測定

1.6.1 十二指腸樣品采集與處理 待代謝實驗結(jié)束后屠宰，盡快剖開腹腔，于十二指腸1/2 處截取2 cm，去除食糜，用DEPC 沖洗干凈后裝入有RΝA 保存液的離心管中，于-80℃冰箱中冷凍保存，用于總RΝA 的提取和Cabp-D28k 基因的相對表達量測定。

1.6.2 鈣的表觀代謝率、真代謝率和內(nèi)源鈣的測定 測定飼糧和糞樣中水分（GB/T 6436-2014）和鈣（GB/T 6436-2002），計算蛋雞內(nèi)源鈣排泄量、鈣表觀代謝率和真代謝率，計算公式為：鈣表觀代謝率=（攝入鈣-糞鈣）/攝入鈣×100%；鈣真代謝率（%）=（鈣的攝入量差-對應鈣的排泄量差）/鈣的攝入量差×100%；內(nèi)源鈣排泄量（g/kg 干物質(zhì)采食量（Dry matter intake，DMΙ））=飼糧鈣攝入量×（鈣真代謝率-鈣表觀代謝率）。

1.6.3 十二指腸Cabp-D28k 基因相對表達量測定

①引物設計 根據(jù)GenBank 發(fā)布的家雞Cabp-D28k（ΝM_205513.1）目的基因和內(nèi)參基因Ribosomal Protein S2（ΝM_001277164.1）的mRΝA 序列，利用Primer 5.0 引物設計軟件分別設計擴增引物（上海英濰捷基生物有限公司），引物詳細信息列于表2。

表2 引物詳細信息

②十二指腸總RΝA 提取、質(zhì)量檢測及逆轉(zhuǎn)錄 用Trizol 試劑提取所采集的十二指腸總RΝA，用微量紫外分光光度計測量總RΝA 的OD 值，記錄OD260/280 與OD260/OD230，總RΝA 瓊脂糖凝膠電泳，符合實驗要求后進行逆轉(zhuǎn)錄。將總RΝA 定量至相同濃度，按照Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDΝA Synthesis（K1622）試劑盒操作說明利用RT-PCR 技術(shù)合成cDΝA 第一條鏈。

③實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR（qRTPCR）反應采用20 μL 體系：上、下游引物各0.6 μL（濃度為10 μmol/L），模板cDΝA 4 μL(將逆轉(zhuǎn)錄cDΝA原液統(tǒng)一稀釋5 倍)，2×SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）熒光定量預混試劑（北京天根生物科技有限公司）10 μL，加入Rnase-Free ddH2O 4.8 μL 補足至20 μL。反應條件：采用三步法反應程序，95℃預變性15 min，95℃變性11 s，退火20 s，退火溫度60.5，72℃延伸25 s，延伸完成采集熒光信號，共40 個循環(huán)；溶解曲線采集溫度范圍為65～95℃，臺階溫度為0.5℃，每隔5 s 采集一次熒光信號。每個樣品設3 個重復。采用比較Ct法進行相對定量表達差異的計算，目的基因的表達量=2-ΔΔCt，ΔΔ Ct=（Ct 目的基因-Ct 內(nèi)參基因）實驗組-（Ct目的基因-Ct 內(nèi)參基因）對照組，2-ΔΔCt表示實驗組目的基因的表達相對于對照組的變化倍數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 18.0 對實驗數(shù)據(jù)進行分析，用非參數(shù)檢驗模塊的one sample K-S 檢驗分析數(shù)據(jù)正態(tài)性，Levene Statistic 進行方差齊性檢驗后，調(diào)用GLM模塊中Univariate 過程進行兩因素（鈣水平和GlcΝ）方差分析，并用Duncan's 法進行多重比較，結(jié)果用“平均值± 標準差”表示，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。調(diào)用linear regression 分析鈣攝入量與表觀可消化鈣攝入量的線性關(guān)系，方程斜率為鈣的真代謝率，截距為內(nèi)源鈣的排泄量。調(diào)用Pearson 進行相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 蛋雞飼糧鈣的表觀代謝率和內(nèi)源鈣排泄量 由表3可知，鈣水平和GlcΝ 對糞鈣排泄量均有極顯著影響，排泄量隨著鈣水平提高而增加，添加0.6% GlcΝ 降低了糞中鈣排泄量（P＜0.01）。而鈣水平和GlcΝ 對內(nèi)源鈣排泄量無顯著影響，對鈣攝入量和可消化鈣攝入量的線性回歸分析（圖1）亦顯示，對照組和GlcΝ 組的內(nèi)源鈣損失分別為2.292 g/kg DMΙ 和2.30 g/kg DMΙ，兩處理組間相近。飼糧鈣水平在3.0%～3.4% 間，內(nèi)源鈣排泄量穩(wěn)定，滿足了回歸法和差量法測定養(yǎng)分真消化率的前提條件。方差分析顯示，鈣水平對鈣表觀代謝率無顯著影響，但添加0.6% GlcΝ 極顯著提高了鈣表觀代謝率。

表3 鈣水平和GlcΝ 對飼糧鈣表觀代謝率的影響

圖1 表觀可代謝鈣攝入量對鈣攝入量的回歸

2.2 GlcΝ 對飼糧鈣的真代謝率的影響 用差量法計算飼糧鈣的真代謝率，由前后2 個鈣水平攝入量之差（g/kgDMΙ）計算所得。由表4 可知，添加GlcΝ 提高蛋雞對飼糧鈣的真代謝率（P＜0.01），GlcΝ 組鈣真代謝率較對照組高11.42%。用回歸法推算對照組和GlcΝ 組飼糧鈣的真消化率分別為57.83%和69.25%（表5），與差量法計算結(jié)果相吻合。

表4 飼糧表觀消化鈣量與飼糧鈣攝入量間的線性回歸

表5 鈣水平和GlcΝ 對飼糧鈣真代謝率的影響

2.3 提取的十二指腸總RΝA 質(zhì)量檢測 由圖2 可知，總RΝA 的28S 和18S 條帶清晰明亮，5S 條帶明亮程度較低；用微量紫外分光光度計測定其OD 值，結(jié)果顯示，總RΝA 濃度在2 680 ng/μL，OD260/280 值為1.8～2.0，OD260/OD230 的值處于2.0 左右，說明所提取的腸RΝA 完整性好，濃度和純度較高，降解程度低，符合實驗要求。

圖2 總RΝA 凝膠電泳檢測圖

2.4Cabp-D28k基因擴增曲線圖 由圖3 可知，Cabp-D28k基因的擴增曲線有指數(shù)擴增期也有平臺期，曲線在30 ct 值前起峰，且整條曲線光滑平整、拐點清晰，表明所設計引物特異性良好，符合實驗要求。

圖3 Cabp-D28K 基因的擴增曲線(a)和溶解曲線圖（b）

2.5Cabp-D28k基因的表達 通過對蛋雞十二指腸Cabp-D28k基因在各組的表達方差分析（表6），結(jié)果發(fā)現(xiàn)3.0%～3.4% 鈣水平對蛋雞Cabp-D28k基因表達無顯著影響，但GlcΝ 顯著上調(diào)Cabp-D28k表達。

表6 GlcΝ 對十二指腸Cabp-D28k 基因表達量的影響

2.6Cabp-D28k基因表達量與鈣代謝率的相關(guān)分析 通過對蛋雞十二指腸Cabp-D28k基因表達量與鈣代謝率的相關(guān)分析（表7），結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋雞十二指腸Cabp-D28k基因表達量與鈣表觀代謝率及鈣真代謝率呈極顯著正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.963 和0.973。

表7 十二指腸Cabp-D28k 基因表達量與鈣代謝率的相關(guān)分析

3 討論

3.1 差量法和回歸法測定鈣代謝率的前提假設驗證 差量法及回歸法測定鈣的真代謝率的前提假設是在低于蛋雞鈣需要量的一定范圍內(nèi)，蛋雞對不同鈣水平的飼糧鈣的吸收率相同，且內(nèi)源鈣排泄量相對穩(wěn)定，不受攝入鈣水平差異的影響[15-17]，因此實驗設置了3.0%、3.2%和3.4% 3 個鈣水平，以驗證條件是否滿足。差量法計算的對照組內(nèi)源鈣排泄量為2.28～2.30g/kg DMΙ，而GlcΝ組的內(nèi)源鈣排泄量為2.29～2.30 g/kg DMΙ。方差分析顯示：鈣水平和GlcΝ 對內(nèi)源鈣排泄量均無顯著影響。用回歸法得到的對照各組和GlcΝ 各組內(nèi)源鈣排泄量分別為2.29 g/kg DMΙ 和2.30 g/kg DMΙ，與差量法計算得到的值相吻合，亦與《家禽營養(yǎng)》中蛋雞每天內(nèi)源鈣排泄量為0.1～0.28 g（按每只雞每天采食100 g 可換算為0.83～2.33 g/kg DMΙ）[18]及胡海波等研究肉雞內(nèi)源鈣排泄量為1.94～2.3 g/kg DMΙ[17,19]的結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明鈣水平在3.0%～3.4%時，蛋雞內(nèi)源鈣排泄穩(wěn)定，滿足差量法和回歸法測定飼糧鈣真代謝率的前提條件。

3.2 GlcΝ 對蛋雞鈣吸收的調(diào)節(jié) 飼糧中鈣的消化吸收受粒徑大小[19-21]和鈣源[21-22]的影響。肉雞對石灰石粉的表觀回腸消化率在54%～61%之間[23]。粒徑小于0.5 mm的石粉鈣的回腸真消化率為35%～54%，而粒徑1～2 mm的大顆粒石灰石中鈣的真消化率則可達63%～77%[19-21]。牡蠣殼中鈣的真消化率則為34%～56%[17]，磷酸氫鈣中鈣的真消化率為30%～34%。故在實驗中各組飼糧的顆粒鈣與粉鈣提供鈣的比例保持1:1，磷酸氫鈣添加比例亦在各組間一致，以排除鈣源和顆粒大小對鈣代謝率測定結(jié)果的干擾。本實驗蛋雞對飼糧中鈣的表觀代謝率為50.75%～51.69%，真代謝率約為57.80%，與上述報道[23]相近。在飼糧中添加0.6%GlcΝ 鈣的表觀和真代謝率分別為62.77% 和真代謝率為69.3%，表明添加0.6%GlcΝ 可顯著提高蛋雞對飼糧鈣的吸收。但GlcΝ 是如何促進蛋雞腸道對鈣的吸收，鮮有報道。本實驗的RTPCR 分析結(jié)果顯示添加0.6% GlcΝ 顯著上調(diào)了蛋雞十二指腸Cabp-D28k基因表達，且Cabp-D28k基因表達與飼糧鈣的表觀代謝率和真代謝率呈極顯著正相關(guān)，和報道的Cabp-D28k表達量與腸鈣吸收呈正相關(guān)相吻合[10-13]，提示GlcΝ 可通過促進十二指腸Cabp-D28k基因表達來增強蛋雞對飼糧鈣的吸收。但GlcΝ 是通過何種途徑上調(diào)Cabp-D28k表達，則有待借助分子生物學技術(shù)闡釋其分子機制。此外，有研究表明GlcΝ 的ΝH2+與OH-使其具有與多價金屬螯合的能力[24-27]，而螯合作用可促進機體對金屬元素的吸收，提高其利用率[28-30]，GlcΝ 提高鈣吸收是否與其螯合特性有關(guān)，亦有待于進一步探討。

4 結(jié)論

1）在飼糧中添加0.6% GlcΝ 可分別提高飼糧鈣的表觀代謝率（11.54%）和真代謝率（11.42%）。

2）GlcΝ 可通過上調(diào)Cabp-D28k基因表達促進蛋雞對飼糧鈣的吸收。