甘麥鄰，劉 麟，趙 雪，鄭 婷，郭宗義，沈林園，潘紅梅，張 亮，王金勇*，朱 礪*

（1.四川農業(yè)大學動物科技學院，四川成都 611130；2.四川農業(yè)大學畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點實驗室，四川成都 611130；3.重慶市畜牧科學院，重慶 402460）

動物人工授精技術可以極大提升優(yōu)秀種公畜的利用效率和利用空間，故被稱作家畜繁殖領域的第一次革命，而精液冷凍技術則可以突破時空限制進一步放大優(yōu)秀種公畜的影響[1]。牛、羊等少數(shù)畜種精液冷凍技術較為成熟，已經(jīng)得到大范圍推廣和應用，而豬的精子脂質含量高，質膜結構特殊，導致豬精子的抗凍性較差，精液冷凍后存活率低、凍精配種受胎率低，在商業(yè)生產(chǎn)中的應用受到限制[2]。當前，豬應用冷凍精液進行人工授精的比例不足1%[3]。

冷凍精液除了面臨冷凍過程的低溫打擊，還要面臨解凍過程的復蘇傷害[4]。豬精液冷凍和復蘇過程同樣經(jīng)歷了“固態(tài)——液態(tài)”2 種形態(tài)的轉變，因此豬冷凍精液的解凍過程與豬精液冷凍過程非常重要[8]。長期以來，研究人員將主要精力集中于降低精子冷凍過程的低溫打擊[5]，并開發(fā)出了一系列降低精子低溫打擊的方法[6]和相關冷凍保護劑[7]，對豬冷凍精液的解凍研究相對缺乏。榮昌豬是世界八大優(yōu)良豬種之一，主產(chǎn)于重慶榮昌和四川隆昌兩地，具有早熟、耐粗飼、適應性強、性情溫馴和肉品質好等特點，是我國地方品種中西南型的主要代表豬種之一。本實驗旨在研究不同解凍液、不同解凍溫度和時間對榮昌豬冷凍精液解凍效果的影響，使用因子分析法評估和篩選不同解凍液適用的最佳解凍程序，以期為榮昌豬資源保護和推廣利用相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料 如無特殊說明，所用試劑均購自索萊寶科技有限公司（北京），精液為健康榮昌豬的0.25 mL細管冷凍精液。

1.2 解凍液配制 商業(yè)解凍液M（Androhep? CryoGuard Thaw Extender，Mintub，德國）按說明書進行配制。自配解凍液J 和C 為四川農業(yè)大學豬遺傳育種團隊結合前期研究和查閱文獻的基礎上自行配制[8]，配方見表1。

表1 自配解凍液配方 g

1.3 解凍方法 將凍精細管從液氮中取出后迅速放入提前預熱的恒溫水浴鍋（32、37、42、47、52℃），按下計時鍵（記10 s 或20 s），并緩慢攪動水浴，待計時器報警，立即從水浴中取出凍精細管，用干凈的紙巾擦干細管。剪開細管的兩端，使解凍融化的精液自行流入干凈容器，按1:9 的比例將凍融精液與解凍液混合。從凍融精液與解凍液混合時開始計算凍精解凍后的保存時間。將與解凍液凍混合的凍融精液分為2 份，1 份置于37℃水浴中孵育，待測。另1 份放入17℃恒溫箱保存24 h 后檢測。

1.4 精子指標檢測 使用前在37℃載物臺對計數(shù)板進行預熱，將解凍后的精液樣品緩慢注入計數(shù)待檢計數(shù)室，使之均勻流入整個計數(shù)室，再在顯微鏡下觀察并使用精子自動分析系統(tǒng)（AndroVision，Minitube，德國）分析精子活率、活力快速前進運動精子數(shù)、慢速運動精子數(shù)等指標。

1.5 最適解凍溫度和時間篩選 分別于精液解凍后3、6、9、12、15、18、21、24、30 min 及1、24 h 檢測精子在不同條件（32℃ 20 s；37℃ 10 s；37℃ 20 s；42℃10 s；42℃ 20 s；47℃ 10 s；47℃ 20 s 和52℃ 10 s）下解凍后精子的凍后活力、活率、快速前進運動精子率和慢速前進運動精子比率。為便于因子分析結果的描述，將冷凍精液解凍后的最高活率所對應的精子活力、快速前進運動精子和慢速解凍精子定義為即時精子指標，將解凍后17℃保存24 h 的精子活率和活力記為精子保存指標，記錄10 個不同解凍時間對應高于40%活率數(shù)、活力高于30%數(shù)，記為精子持續(xù)指標。

1.6 因子分析步驟 ①收集和處理數(shù)據(jù)；②計算相關系數(shù)矩陣；③使用主成分分析法提取因子，計算分析特征值1 的主成分貢獻率；④采用正交旋轉法獲得成分得分系數(shù)矩陣；⑤利用成分得分系數(shù)矩陣求得各主成分得分；⑥進一步使用特征值1 的主成分的總體貢獻率百分比作為權重計算綜合得分。

1.7 統(tǒng)計分析 使用WPS office 進行數(shù)據(jù)初步處理和整理，使用SPSS 20.0 軟件進行因子分析篩選不同解凍液對應的最適解凍溫度和時間。

2 結果與分析

2.1 解凍液M 對精子凍后質量的影響 如圖1 所示，解凍液M 對不同解凍溫度和解凍時間解凍的精子活率和活力均呈緩慢下降，快速前進運動精子呈快速下降趨勢，而慢速運動精子數(shù)隨解凍時間延長基本維持。3 個條件下（37℃ 10 s；42℃ 20 s；47℃ 10 s）解凍的精子置于17℃保存24 h，仍有高于30% 的活率。此外，本研究所設各種解凍溫度以10 s 或20 s 解凍后，各項檢測指標無典型的隨溫度或時間變化而變化的趨勢。

圖1 解凍液M 不同解凍溫度和時間對解凍后精子活率的影響

2.2 解凍液J 不同解凍溫度和時間對精子指標的影響如圖2 所示，使用解凍液J 進行解凍時，不同解凍溫度和解凍時間條件下解凍的精液每項檢測指標的結果也表明解凍后的精子指標無典型隨解凍溫度或解凍時間變化而變化的特征。使用解凍液J 進行解凍時不同解凍溫度和解凍時間程序解凍的精子活率、活力和快速運動精子數(shù)均呈現(xiàn)緩慢先上升后下降的變化趨勢，慢速運動精子數(shù)在解凍后30 min 內基本維持在相近水平。

圖2 解凍液J 不同解凍溫度和時間對解凍后精子活率的影響

2.3 解凍液C 不同解凍溫度和時間對精子指標的影響如圖3 所示，使用解凍液C 進行解凍時，與解凍液M和J 類似，以不同程序解凍的精子，其凍后精子的每項檢測指標也無典型隨解凍溫度或解凍時間變化而變化的特征。使用解凍液C 進行解凍后的精子各項檢測指標隨時間變化與解凍液M 相似，而不同于解凍液J。此外，慢速運動精子數(shù)在30 min 內呈緩慢增加趨勢。

圖3 解凍液C 不同解凍溫度和時間對解凍后精子活率的影響

2.4 3 種解凍液對解凍后精子指標的影響 從圖4 中可以看出，解凍液M 解凍后的精子活率和精子活力曲線可與解凍液M 和C 分離，顯示出更好的效果。此外解凍液C 解凍后隨時間推移精子活率、活力和快速前進運動精子下降速度快于解凍液M 和J。

圖4 不同解凍液不同解凍溫度和時間對解凍后精子活率的影響

2.5 不同解凍液最適解凍溫度和時間篩選 從旋轉成分矩陣（表2）可以看出，解凍液M 第1 主成分主要反映保存指標和持續(xù)指標（47℃ 10 s 最高），第2 主成分主要反映即時指標（47℃ 20 s 最高），第3 主成分主要反映慢速前進運動精子（37℃ 20 s 最高）；解凍液J 第1 主成分主要反映即時指標和持續(xù)指標（32℃ 20 s最高），第2 主成分主要反映保存指標（42℃ 10 s 最高）；解凍液C 第1 主成分主要反映持續(xù)指標（32℃20 s 最高），第2 主成分主要反映即時指標（52℃ 10 s最高），第3 主成分主要反映活力和快速前進運動精子（52℃ 10 s 最高）。計算綜合得分，顯示解凍液M 和J 最適解凍方式為42℃ 20 s；解凍液C 最適解凍方式為32℃ 20 s。利用因子分析計算得到的最適解凍溫度和時間，則解凍后的精子指標在3 種解凍液中差距進一步縮?。▓D6）。

圖6 不同解凍液不同解凍溫度和時間對解凍后精子活率的影響

表2 不同解凍液不同解凍溫度和時間旋轉成分矩陣

圖5 不同解凍液不同解凍溫度和時間對應綜合指數(shù)

3 討論

3.1 不同解凍液對榮昌豬精液冷凍后解凍效果的影響使用合適的方法和手段使豬精子在液氮中固態(tài)保存時存活固然重要，而使液氮中存活的精子成功復蘇也非常重要。解凍液成分不同是影響解凍效果的主要因素之一。本研究發(fā)現(xiàn)，3 種不同解凍液在相同的解凍程序下，最高解凍活率之間相差8.17%，最高解凍活力相差7.13%。

冷凍精液目前主要有低溫緩慢解凍（5℃）、室溫中速解凍（15℃）、體溫快速解凍（37～40℃）以及高溫超快速解凍（50℃以上）等解凍方式[9]，不同畜種冷凍精液的解凍溫度又各有不同。目前豬的冷凍精液報道的最低解凍溫度為37℃，最高解凍溫度為70℃[10]，而牛的冷凍精液可以在90℃高溫下解凍[11]。盡管有不少研究認為，高溫超快速解凍效果較好[12]，但需要精確控制時間，且因為豬人工授精所需精子量通常在40 億～80 億，而常用的0.25 mL 和0.5 mL 規(guī)格凍精一支僅含1 億～2 億精子，因此一次配種需要同時解凍多份冷凍精液，難以保證解凍時間的一致性，很容易因時間控制不精確而燙傷精子[13]，因此不建議在實際生產(chǎn)中使用高溫超快速解凍[14]。本試驗中3 種不同解凍液的不同解凍溫度和時間的解凍曲線不能完全分離，表明32～52℃是一個較為溫和的溫度范圍，能夠獲得較為穩(wěn)定的解凍效果。本研究中，解凍精子的各項性狀并沒有隨著不同解凍溫度和解凍時間而表現(xiàn)出規(guī)律性的上升或下降。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，豬冷凍精液解凍后精子指標快速下降，至1 h 左右時下降到最高水平的60%左右，而置于17℃保存精液24 h 后精子各項指標較1 h 更高，因此豬冷凍精液解凍后應當快速使用，當不能立即使用時，最好保持在17℃放置更有利于精子活力的維持[15]。

3.2 不同解凍液最適解凍溫度和時間的篩選方法構建豬精液解凍后，通常并不能即刻輸入母豬體內，且精子在母豬生殖道仍然需要時間運動到合適位置，因此解凍后精子需要維持一定的活率和活力[16]。針對部分條件較差的豬場，往往還需要解凍后進行一段時間的運輸，因此可能需要短期儲存。為評價豬冷凍精液保存效果，將冷凍精液解凍后的最高活率所對應的精子活力、快速前進運動精子和慢速解凍精子定義為即時精子指標；將17℃保存24 h 的精子活率和活力記為保存指標；記錄10 個不同解凍時間對應高于40%活率數(shù)，和活力高于30%數(shù)，記為持續(xù)指標。由于本研究中所用豬冷凍精液解凍后在17℃繼續(xù)保存24 h 后的精子活率和活力已經(jīng)很低，快速運動精子數(shù)和慢速運動精子數(shù)比例更低，會導致誤差較大，且現(xiàn)有標準和評價指標重點關注豬精子活力[17]，未對本研究涉及其他指標做要求。因此，本研究模型中未將這些指標納入分析，后續(xù)如果有需要可以將這些指標一并納入分析。

經(jīng)計算分析發(fā)現(xiàn)，解凍液M 和J 的最適解凍方式為42℃ 20 s；解凍液C 的最適解凍方式為32℃ 20 s，利用通過因子分析計算得到的最適解凍溫度和時間進行解凍，發(fā)現(xiàn)解凍后的精子指標在3 種解凍液之間的差距進一步縮小，各指標進一步提升，表明使用通過綜合分析篩選最佳解凍程序后可進一步挖掘解凍液潛力。

4 結論

本研究結果表明，利用不同解凍液在解凍榮昌豬冷凍精液時具有不同的最適解凍溫度和時間，解凍液M和J 最適解凍方式為42℃ 20 s；解凍液C 最適解凍方式為32℃ 20 s。針對不同解凍液最佳解凍程序不同，通過綜合分析可進一步發(fā)掘解凍液潛力，降低生產(chǎn)浪費并提升經(jīng)濟效益。