李景偉，于 卓，于肖夏，李佳奇，盧倩倩，吳國芳，李 靚

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

馬鈴薯是世界上重要的糧食作物[1-2]，其塊莖中含有豐富的淀粉、維生素、膳食纖維、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)和花青素等營養(yǎng)成分，可滿足人體需要的各種營養(yǎng)需求[3-5].近年來，我國逐漸意識(shí)到馬鈴薯在糧食安全、國民經(jīng)濟(jì)、生態(tài)安全等方面的重要作用，于2016年由國務(wù)院批準(zhǔn)實(shí)施馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略[6].在國家政策的引導(dǎo)下，我國馬鈴薯種植面積及其總產(chǎn)量明顯增加.但與美國、荷蘭、加拿大等馬鈴薯產(chǎn)業(yè)鏈發(fā)展良好的國家相比，我國多以鮮食型馬鈴薯品種為主，而淀粉、全粉、薯?xiàng)l薯片等加工專用型馬鈴薯新品種嚴(yán)重缺乏，遠(yuǎn)不能滿足當(dāng)前消費(fèi)市場(chǎng)的需求[7].隨著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，亟待引進(jìn)和拓寬加工專用型的馬鈴薯的種質(zhì)資源，并在確保育成品種優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)的前提下，需充分改良現(xiàn)有品種的加工品質(zhì)特性，提高其加工原料的品質(zhì).因此，開展優(yōu)良加工專用型馬鈴薯新品種的選育研究工作十分必要.

SRAP(Sequence related amplified polymorphism)序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記，是一種可直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增且無須特定序列信息的新型分子標(biāo)記，因其具有重復(fù)性和通用性好、多態(tài)性豐富、操作簡(jiǎn)單且成本低等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用在多種作物的遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源研究等領(lǐng)域[8].

為培育出優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)、商品性好、生育期較短，適宜內(nèi)蒙古地區(qū)推廣種植的優(yōu)良加工專用型馬鈴薯新品種，近年來本課題組以雙親遺傳差異大、優(yōu)缺點(diǎn)互補(bǔ)為親本選配原則，用抗病性弱但塊莖產(chǎn)量和商品薯率高、薯型好、芽眼淺、紅皮白肉的‘美紅-09’(MH-09)材料作母本，以抗病性強(qiáng)、高干物質(zhì)和高淀粉含量、深紅皮紅肉的‘MIN-21’材料為父本，通過人工套袋去雄授粉雜交獲得2 604個(gè)雜種F1代分離單株群體.經(jīng)在溫室和大田對(duì)雜種后代進(jìn)行多次選擇，從中選出了綜合農(nóng)藝性狀表現(xiàn)突出的8個(gè)優(yōu)良雜種株系：ZX-20、ZX-460、ZX-780、ZX-900、ZX-1120、ZX-1540、ZX-1960和ZX-2200.

本試驗(yàn)以這8個(gè)優(yōu)良雜種株系及其親本為材料，采用醋酸洋紅花粉粒染色及卡寶品紅染色體壓片法，分別對(duì)其花粉育性及花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期I(PMIM I)的染色體配對(duì)行為進(jìn)行了觀察分析，并對(duì)其基因組DNA進(jìn)行了SRAP分析，以明確各雜種株系間花粉育性情況、染色體配對(duì)構(gòu)型特征和DNA水平的遺傳差異，以為下一步馬鈴薯新品系(品種)的育成、登記應(yīng)用提供分子細(xì)胞學(xué)依據(jù).

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為從馬鈴薯雜交組合‘MH-09×MIN-21’的雜種F1代群體中選育出的8個(gè)優(yōu)良雜種無性株系ZX-20、ZX-460、ZX-780、ZX-900、ZX-1120、ZX-1540、ZX-1960和ZX-2200及其親本.種薯級(jí)別為原種，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯育種研究所保存、提供.各供試材料的塊莖表型特征如圖1所示.

a：ZX-20，b：ZX-460，c：ZX-780，d：ZX-900，e：ZX-1120，f：ZX-1540，g：ZX-1960，h：ZX-2200，i：♀MH-09，j：♂MIN-21

1.2 試驗(yàn)地概況及田間管理方法

2018年5月6日，將各供試材料種植在呼和浩特市托克托縣古城鎮(zhèn)馬鈴薯試驗(yàn)研究基地.試驗(yàn)區(qū)的地理位置為東經(jīng)111°45′、北緯40°57′，海拔約1 061 m.試驗(yàn)區(qū)年平均降雨量為336.2～535.7 mm，無霜期約145 d，生育期日照時(shí)間約1 600 h；土壤為沙壤質(zhì)土，肥力中等，pH呈弱堿性，具備良好的噴灌條件.各材料按隨機(jī)區(qū)組排列設(shè)計(jì)，采用單壟穴播方式種植，株距30 cm，行距90 cm，播種深度10 cm左右，小區(qū)面積20 m2，設(shè)3次重復(fù).播種前用完全腐熟的牛糞(2.25 kg/m2)作為基肥，馬鈴薯復(fù)合肥(0.07 kg/m2)作種肥.在生育期內(nèi)適當(dāng)追施氮肥(0.05 kg/m2)，分3次施入.在株高約15 cm時(shí)，進(jìn)行中耕培土.在整個(gè)生育期，注意防除病蟲和雜草的危害，適時(shí)灌水滿足植株生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)水分的需求.

1.3 花粉育性的觀測(cè)

在開花期，取8個(gè)優(yōu)良雜種株系及其親本材料正在開放的花蕾，分別放在羊皮紙袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室.用鑷子將花粉均勻地抖落在載玻片上，醋酸洋紅染液均勻染色后加蓋玻片，用Olympus BX51的顯微鏡10倍下觀察各材料的花粉育性情況.每個(gè)材料觀察100個(gè)視野以上，統(tǒng)計(jì)出可育花粉與不可育花粉的數(shù)目并拍照[9].觀察的標(biāo)準(zhǔn)為：花粉粒飽滿、均勻著色的記為可育花粉粒，花粉?？瞻T、皺縮扁小畸形、不著色的記為不可育花粉[10].

花粉可育率=(可育花粉粒數(shù)/花粉粒統(tǒng)計(jì)總數(shù))×100%.

1.4 PMCMⅠ染色體配對(duì)構(gòu)型觀測(cè)

馬鈴薯現(xiàn)蕾期間，在上午的8：00—10：00，隨機(jī)取各雜種株系及其親本的幼小花蕾(0.2 cm)，將鮮樣迅速放入裝有卡諾液(V無水乙醇∶V冰醋酸=3∶1)的具塞試管中帶回室內(nèi)，置4℃冰箱內(nèi)固定約24 h后，用清水沖掉卡諾液及雜質(zhì)，加入70%的酒精于4℃冰箱內(nèi)保存、備用[11].制片時(shí)，將花粉母細(xì)胞擠壓到干凈的載玻片上，去除花藥壁，滴加卡寶品紅染液染色約10 s后壓片.用Olympus顯微鏡于100倍油鏡下觀察供試材料的染色體配對(duì)行為，挑選染色均勻、清晰穩(wěn)定的細(xì)胞染色體進(jìn)行照相，并統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)目[12-13]，每個(gè)材料觀察細(xì)胞數(shù)在140個(gè)以上，參照李懋學(xué)等[14]提出的方法對(duì)各雜種株系的染色體構(gòu)型進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì).

1.5 供試材料的DNA提取與純度檢測(cè)

在苗期隨機(jī)取各材料的幼嫩葉片，按照北京天根公司生產(chǎn)的DNA試劑盒說明書提取其基因組DNA.取2 μL 樣本DNA溶液，用1.3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度后，稀釋至50 ng/μL，置-40℃冰柜中保存、備用.

1.6 SRAP-PCR擴(kuò)增體系及程序

PCR反應(yīng)體系：總體積為20 μL，其中包含上、下游引物(0.5 μmol/L)各1.2 μL，2.5 μL的10×PCR buffer(含Mg2+)，2.5 μL模板DNA(50 ng/μL)，1.6 μL dNTPs(0.225 mmol/L)，0.2 μL Taq DNA聚合酶(5 U)和10.8 μL ddH2O.實(shí)驗(yàn)所用的生化試劑均購自北京全式金生物工程有限公司.

PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸1 min，5個(gè)循環(huán)；94℃變性，50℃退火，72℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min后，將擴(kuò)增產(chǎn)物置于4℃冰箱內(nèi)低溫保存.PCR反應(yīng)在Bio-Rad Mycycler Thermal Cycler基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行[15].

1.7 SRAP適宜引物的篩選

從Li等[16]、Pezzotti等[17]和Lin等[18]報(bào)道的SRAP引物中，隨機(jī)選取正向12條、反向12條引物，自由組合成144對(duì)引物，委托南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行合成.通過預(yù)實(shí)驗(yàn)從中篩選出10對(duì)多態(tài)性豐富、條帶位點(diǎn)穩(wěn)定、清晰的SRAP特異性引物(見表1)，用于8個(gè)馬鈴薯優(yōu)良雜種株系及其親本遺傳差異的SRAP分析.

表1 篩選出的SRAP適宜引物及其堿基序列

1.8 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)及SRAP多態(tài)性位點(diǎn)條帶

用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)供試材料基因組DNA 的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè).依據(jù)Nei[19]提出的方法，統(tǒng)計(jì)各引物擴(kuò)增出的SRAP等位基因多態(tài)性位點(diǎn)條帶和總位點(diǎn)條帶，計(jì)算出多態(tài)性位點(diǎn)條帶百分率(Percentage of polymorphic bands，P).P=(M/N)×100%，式中：M為擴(kuò)增出的多態(tài)性位點(diǎn)條帶數(shù)，N為擴(kuò)增出的總位點(diǎn)條帶數(shù).

1.9 數(shù)據(jù)的整理分析

用EXCEL2010和SPSS(Statistical product and service solutions)22.0軟件對(duì)各雜種株系的花粉可育率觀測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析.采用DPS(Data processing system)V7.05軟件進(jìn)行SRAP遺傳距離的聚類分析

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯優(yōu)良雜種株系間花粉育性的差異

8個(gè)優(yōu)良雜種株系及其親本的花粉育性觀測(cè)結(jié)果見圖2、表2.親本間的花粉可育率在60%左右，二者差異不明顯，各株系間的花粉可育率存在一定差異.株系ZX-900的花粉可育率最高，為77.3%；株系ZX-1120、ZX-460和ZX-20的花粉可育率相近，在68.0%～71.8%之間，三者差異不顯著，但與親本存在顯著差異；株系ZX-780和ZX-2200分別為61.3%和64.4%，二者差異不顯著，且與其雙親差異顯著；株系ZX-1960和ZX-1540的花粉可育率均較低，分別為55.4%和48.1%，差異顯著.以上結(jié)果表明，除株系ZX-1540外，其余7個(gè)雜種株系的花粉育性均超過50%，可作父本材料進(jìn)一步用于雜交改良.

2.2 雜種株系間的PMCMⅠ染色體配對(duì)行為

各雜種株系及其親本的染色體構(gòu)型如表2和圖3所示.母本‘MH-09’的染色體構(gòu)型為2n=4x=48=5.38Ⅰ+8.98Ⅱ+4.63Ⅲ+2.69Ⅳ，父本‘MIN-21’的染色體構(gòu)型為2n=4x=48=2.80Ⅰ+9.35Ⅱ+4.51Ⅲ+3.23Ⅳ.各株系間的單價(jià)體頻率變幅在1.13～8.44之間，二價(jià)體頻率變幅在7.08～15.54之間，三價(jià)體頻率變幅在1.04～6.76之間，四價(jià)體頻率變幅在1.33～5.09之間.8個(gè)雜種株系ZX-20、ZX-460、ZX-780、ZX-900、ZX-1120、ZX-1540、ZX-1960和ZX-2200的染色體構(gòu)型有一定差別，依次分別為：2n=4x=48=3.82Ⅰ+13.05Ⅱ+2.31Ⅲ+2.79Ⅳ，2n=4x=48=6.52Ⅰ+13.04Ⅱ+2.24Ⅲ+2.17Ⅳ，2n=4x=48=4.37Ⅰ+9.97Ⅱ+3.19Ⅲ+3.53Ⅳ，2n=4x=48=4.05Ⅰ+15.54Ⅱ+2.12Ⅲ+1.63Ⅳ，2n=4x=48=2.71Ⅰ+13.85Ⅱ+2.35Ⅲ+2.64Ⅳ，2n=4x=48=8.44Ⅰ+7.08Ⅱ+5.92Ⅲ+1.91Ⅳ，2n=4x=48=5.20Ⅰ+8.61Ⅱ+6.76Ⅲ+1.33Ⅳ和2n=4x=48=1.13Ⅰ+11.69Ⅱ+1.04Ⅲ+5.09Ⅳ.

表2 8個(gè)優(yōu)良雜種株系及其親本的花粉育性

a：ZX-20，b：ZX-460，c：ZX-780，d：ZX-900，e：ZX-1120，f：ZX-1540，g：ZX-1960，h：ZX-2200，i：♀MH-09，j：♂MIN-21

2.3 優(yōu)良雜種株系及親本基因組DNA的SRAP分析

8個(gè)馬鈴薯雜種株系及其親本的基因組DNA電泳條帶明亮、穩(wěn)定、均勻，無彌散現(xiàn)象產(chǎn)生，表明所提取的各材料DNA純度很高，完全可滿足SRAP分子標(biāo)記電泳分析的質(zhì)量要求.用篩選出的10對(duì)SRAP適宜引物，對(duì)8個(gè)雜種株系及其親本基因組DNA的擴(kuò)增結(jié)果顯示，共有180個(gè)清晰穩(wěn)定的SRAP位點(diǎn)條帶，其中多態(tài)性位點(diǎn)條帶122個(gè)，多態(tài)性平均比率為65.92%，表明各材料間在DNA水平上有明顯的遺傳差異(見表3、圖4A).

實(shí)驗(yàn)還選出1對(duì)特異性SRAP引物M5BE7，經(jīng)擴(kuò)增建立的指紋圖(見圖4B)可清晰地將各雜種株系間及親本區(qū)分開來.這表明SRAP引物M5BE7可從DNA分子水平上識(shí)別8個(gè)雜種株系的遺傳差異，可為下一步雜種新品系及品種的育成、登記提供了分子依據(jù).

表3 8個(gè)優(yōu)良雜種株系及其親本的SRAP擴(kuò)增結(jié)果

A：DNA純度檢測(cè)；B：引物M5BE7擴(kuò)增指紋.M1：DNA Marker DL100；M2：DNA Marker DL2000

2.4 雜種株系及親本的遺傳距離和聚類分析

由表4可見，10個(gè)材料的遺傳距離(GD)變動(dòng)在0.290～0.640之間，平均距離為0.442.其中株系ZX-1540與父本‘MIN-21’的遺傳距離最大(GD值=0.640)，說明二者的遺傳差異較大.株系ZX-780與父本‘MIN-21’的遺傳距離最小(GD值=0.290)，其遺傳差異相對(duì)較小.

以GD值0.40為基準(zhǔn)，可將10個(gè)材料劃分為5類：株系ZX-20、ZX-1960與母本‘MH-09’為一類，說明ZX-20、ZX-1960偏母本遺傳；株系ZX-780、ZX-1120、ZX-2200與父本‘MIN-21’分為一類，這3個(gè)雜種株系偏父本遺傳；株系ZX-460、ZX-900、ZX-1540單獨(dú)為一類，表明這3個(gè)雜種株系間遺傳差異相對(duì)較小(見圖5)

表4 各株系及其親本的遺傳距離矩陣

3 討論

3.1 染色體配對(duì)行為與花粉育性的關(guān)系

圖5 10個(gè)供試材料的SRAP聚類

染色體是DNA遺傳物質(zhì)的載體，觀測(cè)雜種材料的染色體配對(duì)行為是從細(xì)胞學(xué)水平上了解不同植物材料遺傳差異的基礎(chǔ)，而明確雜種材料花粉育性的高低對(duì)其后續(xù)雜交改良、利用具有理論指導(dǎo)意義，染色體的正常分離是花粉可育的基礎(chǔ)[20].染色體的配對(duì)行為是由多個(gè)基因精準(zhǔn)調(diào)控的，任何基因的變異均會(huì)導(dǎo)致減數(shù)分裂異常，致使花粉敗育，染色體聯(lián)會(huì)時(shí)發(fā)生的不均等分離也會(huì)導(dǎo)致花粉不育.已有的研究表明，植物的染色體構(gòu)型中二價(jià)體頻率較高時(shí)，其花粉可育率較高，若單價(jià)體和多價(jià)體的頻率較高，花粉可育率則較低[21].其原因是二價(jià)體頻率高可使同源染色體正常聯(lián)會(huì)，花粉育性高；而單價(jià)體和多價(jià)體頻率高會(huì)引起聯(lián)會(huì)的同源染色體分離不均衡，染色體配對(duì)異常，致使花粉育性降低[22].

本試驗(yàn)對(duì)8個(gè)馬鈴薯雜種株系的染色體構(gòu)型進(jìn)行的觀測(cè)表明，株系ZX-900和ZX-1120的花粉可育率較高(分別為77.3%和71.8%)，其二價(jià)體頻率亦較高(分別為15.54和13.85)，而單價(jià)體和多價(jià)體頻率相對(duì)較低(分別為4.05和2.71)；ZX-1540和ZX-1960的花粉可育率最低(分別為48.1%和55.4%)，其二價(jià)體頻率亦最低(分別為7.08和8.61)，而單價(jià)體和多價(jià)體頻率較高(分別為8.44和5.20).這表明不同雜種株系花粉可育率的高低與其二價(jià)體頻率的高低呈正相關(guān)，與單價(jià)體及多價(jià)體頻率呈負(fù)相關(guān)，這與已有的研究結(jié)果相吻合，可為后續(xù)8個(gè)優(yōu)良雜種株系作為中間材料進(jìn)一步雜交改良利用，提供可靠的細(xì)胞遺傳學(xué)依據(jù).

3.2 分子標(biāo)記的有效性

分子標(biāo)記是作物遺傳育種研究的重要輔助工具，可明顯縮短育種進(jìn)程，因其是建立在基因組DNA水平上的一類新型技術(shù)，是植物基因的直接表現(xiàn)，且可排除環(huán)境因素的影響，因此備受育種者的重視.McGregor等[23]利用SSR標(biāo)記對(duì)39個(gè)南美當(dāng)?shù)伛R鈴薯栽培品種進(jìn)行了分析，4對(duì)SSR引物有效區(qū)分了其中的24個(gè)材料；Norero等[24]利用SSR標(biāo)記對(duì)來自德國等12個(gè)國家的37個(gè)馬鈴薯品種進(jìn)行了分子鑒定，用3對(duì)引物可將其中的36個(gè)品種區(qū)分開來.與SSR標(biāo)記相比，SRAP標(biāo)記技術(shù)具有多態(tài)性位點(diǎn)多、引物通用性強(qiáng)、引物組合可以隨機(jī)排列形成許多新的引物對(duì)、成本較低廉且操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，故近幾年來其應(yīng)用研究較多.例如，張建成等[25]對(duì)10個(gè)國內(nèi)花生栽培種的SRAP標(biāo)記研究表明，SRAP標(biāo)記技術(shù)可以很好地體現(xiàn)出花生栽培種的遺傳差異性；程永芳等[26]利用SRAP標(biāo)記技術(shù)對(duì)54份馬鈴薯種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，并對(duì)50個(gè)雜種F1單株進(jìn)行了分子鑒定，證明馬鈴薯品種間具有豐富的遺傳多樣性且遺傳差異較大.本試驗(yàn)利用自由組合成的144對(duì)SARP引物篩選出的10對(duì)適宜引物，對(duì)8個(gè)馬鈴薯優(yōu)良雜種株系及親本材料的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得122個(gè)SRAP多態(tài)性位點(diǎn)條帶，其多態(tài)性比率達(dá)65.92%，表明各供試材料間具有較大的遺傳差異，可為后續(xù)雜種株系作為中間材料再利用及馬鈴薯新品系的培育提供分子依據(jù).實(shí)驗(yàn)還利用篩選出的1對(duì)SRAP特異性引物M5BE7，經(jīng)PCR擴(kuò)增建立了能很好識(shí)別各優(yōu)良雜種株系及親本的SRAP指紋圖.這也表明SRAP分子標(biāo)記技術(shù)用于馬鈴薯雜種株系的鑒定是可靠的，可為下一步新品種的育成登記奠定基礎(chǔ).

4 結(jié)論

(1) 8個(gè)馬鈴薯優(yōu)良雜種株系的花粉可育率變幅為48.1%～77.3%，株系間花粉育性存在一定差異.株系ZX-1540的花粉育性最低(<50%)，適宜作母本中間材料雜交改良利用；其余7個(gè)株系的花粉育性均在55%以上，可作父本材料改良利用.

(2) 8個(gè)雜種株系ZX-20、ZX-460、ZX-780、ZX-900、ZX-1120、ZX-1540、ZX-1960和ZX-2200的染色體配對(duì)構(gòu)型，依次分別為：3.82Ⅰ+13.05Ⅱ+2.31Ⅲ+2.79Ⅳ，6.52Ⅰ+13.04Ⅱ+2.24Ⅲ+2.17Ⅳ，4.37Ⅰ+9.97Ⅱ+3.19Ⅲ+3.53Ⅳ，4.05Ⅰ+15.54Ⅱ+2.12Ⅲ+1.63Ⅳ，2.71Ⅰ+13.85Ⅱ+2.35Ⅲ+2.64Ⅳ，8.44Ⅰ+7.08Ⅱ+5.92Ⅲ+1.91Ⅳ，5.20Ⅰ+8.61Ⅱ+6.76Ⅲ+1.33Ⅳ和1.13Ⅰ+11.69Ⅱ+1.04Ⅲ+5.09Ⅳ.

(3) 篩選出SRAP適宜引物10對(duì)，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了122個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)條帶，多態(tài)性比率占65.92%.利用SRAP特異性引物M5BE7，構(gòu)建了能明確識(shí)別8個(gè)優(yōu)良雜種株系及其親本的SRAP指紋圖.

(4) 8個(gè)雜種株系及其雙親的遺傳距離(GD)變幅為0.290～0.640，平均為0.442.以GD值0.40為基準(zhǔn)，將10個(gè)材料分為5類：第一類為株系ZX-20、ZX-1960和母本‘MH-09’；第二類為株系ZX-780、ZX-1120、ZX-2200和父本‘MIN-21’；株系ZX-460、ZX-900和ZX-1540各單獨(dú)成一類.