曾智 孔悅 郭硯

[摘要]目的：探討水母雪蓮（Saussurea Medusa Maxim）多糖對(duì)中波紫外線（Ultraviolet B，UVB）誘導(dǎo)的小鼠皮膚損傷保護(hù)作用的機(jī)制研究，奠定其臨床應(yīng)用理論基礎(chǔ)。方法：30只昆明種雄性小鼠隨機(jī)分為正常組、UVB組、UVB+水母雪蓮組三組。UVB組和UVB+水母雪蓮組皮下注射5% D-半乳糖10ml/（kg·d），同時(shí)每日UVB照射，持續(xù)造模40d;正常組正常光照飼養(yǎng)，每日皮下注射同體積生理鹽水。第11天開(kāi)始，UVB+水母雪蓮組每日按劑量4g/（kg·d）灌胃水母雪蓮多糖，正常組、UVB組則每日灌胃等體積的生理鹽水。連續(xù)用藥30d后觀察小鼠皮膚組織形態(tài)學(xué)變化，測(cè)定皮膚含水量，檢測(cè)水通道蛋白3（AQP3）通路中表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR），細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK），AQP3的表達(dá)。結(jié)果：光鏡下可見(jiàn)UVB+水母雪蓮組較UVB組表皮層變薄，真皮層增厚，纖維組織增多，排列緊密有序。UVB組EGFR和ERK的表達(dá)量高于正常組，AQP3表達(dá)量低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。UVB+水母雪蓮組EGFR和ERK的表達(dá)量低于UVB組，AQP3表達(dá)量高于UVB組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：水母雪蓮多糖能通過(guò)AQP3通路來(lái)減輕UVB導(dǎo)致的小鼠皮膚損傷。

[關(guān)鍵詞]水母雪蓮;皮膚光老化;水通道蛋白;膠原纖維;中波紫外線

[中圖分類號(hào)]R339.3+8? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2021）04-0102-04

The Protective Effect of Saussurea Medusa Maxim Polysaccharide on UVB Induced Skin Injury in Mice

ZENG Zhi1，KONG Yue1，GUO Yan2

（1.Graduate School of Qinghai University，Qinghai 810000，Xining，China;2.Department of Medical Cosmetology，Affiliated Hospital of Qinghai University，Qinghai 810000，Xining，China）

Abstract： Objective? To investigate the protective effect of Saussurea medusa Maxim polysaccharide on UVB induced skin injury in mice， and to lay the theoretical foundation for its clinical application. Methods? Thirty Kunming male mice were randomly divided into three groups， the normal group， the UVB group and the UVB+ Saussurea medusa group. Mice in the UVB group and the UVB+Saussurea medusa group were injected with 5% D-galactose 10ml/（kg?d）subcutaneously and subjected to UVB irradiation for 40d continuously. Mice in the normal group as fed under normal light and was subcutaneously injected with normal saline of the same volume every day. Starting from the 11th day of modeling， mice in the UVB+ Saussurea medusa group was gavaged with a dose of 4g/（kg?d）， mice in the normal group and the UVB group were gavaged with normal saline of the same volume daily respectively. After 30 days， skin histomorphological variation were observed， skin moisture content was measured， and expressions of epidermal growth factor receptor （EGFR）， extracellular regulatory protein kinase （ERK）， and aquaporin 3 （AQP3） in AQP3 pathway were detected. Results? Under light microscope， compared with the UVB group， the epidermis of the UVB+Saussurea medusa group was thinner， the dermis was thicker， and the fibrous tissue was more densely arranged and orderly. The expression of EGFR and ERK in the UVB group were higher than those in the normal group， and the expression of AQP3 was lower than that in the normal group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The expression of EGFR and ERK in the UVB+ Saussurea medusa group were lower than those in the UVB group， and the expression levels of AQP3 was higher than that in the UVB group （P<0.05）. Conclusion? The polysaccharide of Saussurea medusa Maxim can alleviate the skin injury of mice caused by UVB through AQP3 pathway.

Key words： Saussurea Medusa Maxim; skin photoaging; aquaporin; collagenous fiber; UVB

皮膚的光損傷主要是由中波紫外線（UVB）造成的[1-2]。UVB可使皮膚變得干燥、缺水，從而損害角質(zhì)層功能，表現(xiàn)為皮膚粗糙、松弛、質(zhì)地變硬、皺紋形成和傷口延遲愈合[3]。一旦沒(méi)有及時(shí)防范與治療，甚至發(fā)展為光化性角化病，最終導(dǎo)致皮膚鱗狀細(xì)胞癌[4]。

水母雪蓮是一種高原草本植物，為我國(guó)中藏藥中的稀有珍貴藥材。水母雪蓮中含有豐富的黃酮、木素、多糖等成分，具有優(yōu)秀的抗氧化能力，廣泛應(yīng)用到抗炎、抗誘變和抗癌的治療中[5]。研究證實(shí)水母雪蓮（Saussurea Medusa Maxim）多糖能夠明顯恢復(fù)UVB輻射后人永生化表皮細(xì)胞（Hacat）形態(tài)[6]。AQP3是人體內(nèi)重要的膜通道，選擇性地輸送水、甘油和其他化合物[7-8]，并且AQP3在傷口愈合中也扮演很重要的角色，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移，增強(qiáng)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和分化[9]。但目前水母雪蓮多糖通過(guò)AQP3通路對(duì)UVB誘導(dǎo)皮膚損傷保護(hù)作用機(jī)制相關(guān)研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究將進(jìn)一步在動(dòng)物水平探討水母雪蓮多糖對(duì)紫外線誘導(dǎo)小鼠皮膚損傷的保護(hù)作用及相關(guān)分子機(jī)制。

1? 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：小鼠，雄性，30只，健康的SPF級(jí)昆明種小鼠，45d齡，體重20～25g，購(gòu)于西安科奧生物科技有限公司[SXXK（陜）2015-002]。飼養(yǎng)于青海省高原研究中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由攝食飲水。

1.2? 實(shí)驗(yàn)藥物：水母雪蓮多糖（瑞林生物科技，西安）。

1.3? 試劑：水合氯醛、D-半乳糖、強(qiáng)效RIPA裂解液（索萊寶，北京），聚氰基丙烯酸正丁酯（Butyleyanoacrylate， BCA）（賽默飛），HE染色試劑盒、Masson三色染色試劑盒（建成生物，南京），抗磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（Phospho-extracellular regulated kinase， P-ERK）抗體、抗細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinases， ERK）抗體（Cell Signaling Technology），抗磷酸化表皮生長(zhǎng)因子受體（Phospho-Epidermal growth factor receptor， P-EGFR）抗體，抗表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）抗體和抗水通道蛋白3（Aquaporin 3， AQP3）抗體（Abcam，美國(guó)），辣根過(guò)氧化物酶化學(xué)發(fā)光劑（Electrochemiluminescence， ECL）（默克密理博），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗（索萊寶，北京）。

1.4 儀器：40W UVB紫外燈（德國(guó)PHILIPS，311～312nm），全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，UVB輻照度監(jiān)視器（路昌電子企業(yè)有限公司，臺(tái)灣）、電泳儀、化學(xué)發(fā)光成像儀均由青海大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.5? 方法

1.5.1 動(dòng)物分組造模：在室內(nèi)環(huán)境溫度（22℃～25℃），相對(duì)濕度50%～70%環(huán)境下，遵從隨機(jī)分配的原則，將30只小鼠分為3組，每組10只：正常組，UVB組，UVB+水母雪蓮組。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，開(kāi)始給藥造模，所有小鼠背部用脫毛劑脫掉皮膚表面毛發(fā)，暴露約5cm×5cm大小的皮膚，每5d脫毛一次。UVB組與UVB+水母雪蓮組每日頸背部皮下注射5% D-半乳糖10ml/（kg·d）同時(shí)進(jìn)行UVB照射[10]，具體方法如下：紫外線燈管（UVB）功率40W，照射前測(cè)光強(qiáng)度。在每次照射前，讓燈管先預(yù)熱15min，照射過(guò)程中每隔15min均輪換鼠盒位置，來(lái)確保每個(gè)籠子里小鼠接受的光強(qiáng)度一致，每次照射時(shí)間為40min，光源在小鼠正上方約40cm處，持續(xù)造模40d。正常組小鼠正常光照飼養(yǎng)，每日頸背部皮下注射同體積的生理鹽水。造模第11天開(kāi)始，UVB+水母雪蓮組小鼠每天按照4g/（kg·d）的分量將水母雪蓮多糖灌入胃中，正常組與UVB組小鼠則每天灌胃等量的生理鹽水，連續(xù)用藥30d。

1.5.2 取材：實(shí)驗(yàn)第42天，所有小鼠麻醉后，分離出背部的脫毛皮膚。一部分用于皮膚含水量的測(cè)定，一部分制作病理切片，用于HE染色和Masson染色;一部分皮膚-80℃保存進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5.3 干燥法測(cè)定皮膚含水量：用濾紙盡量擦干小鼠皮膚，裁剪頸背部約1cm×1cm范圍左右的脫毛皮膚，將皮膚濕重準(zhǔn)確稱量，然后放入80℃烘箱中，烘干12h，待水分基本散發(fā)后，取出，精密稱量皮膚干重，按照下列公式：皮膚含水百分率（%）=（濕重-干重）/濕重×100%，進(jìn)行計(jì)算。

1.5.4 蛋白免疫印跡法檢測(cè)EGFR、ERK、AQP3的表達(dá)：分別收集不同組的小鼠背部皮膚組織，加入剛從4℃冰箱取出的RIPA裂解液，在4℃低溫的環(huán)境下，離心15min后取上清，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。用蛋白上樣緩沖液配置蛋白體系后95℃煮10min，將樣品加入到配好的凝膠中進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，立即進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，再用脫脂奶粉室溫下封閉，Tris緩沖鹽溶液+Tween（Tris-buffered saline-Tween，TBST）洗膜3次，每次5min。加入一抗（抗ERK抗體，抗磷酸化ERK抗體，抗EGFR抗體，抗磷酸化EGFR抗體，抗AQP3抗體，抗GAPDH抗體）4℃孵育過(guò)夜后，TBST洗膜3次，每次5min，加入HRP標(biāo)記的抗兔的IgG抗體孵育1h，TBST洗膜3次，每次10min。此后按顯色試劑盒說(shuō)明書(shū)操作顯色。使用Image J進(jìn)行條帶分析。

1.5.5 免疫組化：將4μm石蠟切片經(jīng)過(guò)二甲苯脫蠟，梯度無(wú)水乙醇脫水，3%過(guò)氧化氫孵育10min后，磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate buffer saline，PBS）清洗。血清封閉后，于AQP3抗體（抗體與抗體稀釋液稀釋體積比為1∶100）中4℃孵育過(guò)夜，抗兔IgG酶標(biāo)抗體37℃孵育。辣根過(guò)氧化酶孵育后，二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）染色，蘇木素復(fù)染。制片后在10倍、40倍顯微鏡下隨機(jī)選取視野拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（x?±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 小鼠皮膚肉眼觀察：在造模第10天、第20天、第30天、第40天對(duì)三組小鼠背部裸露皮膚拍照，肉眼觀察結(jié)果如圖1所示，可發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的推移，UVB組小鼠皮膚狀態(tài)逐漸變差，UVB+水母雪蓮組小鼠的皮膚狀態(tài)恢復(fù)正常。在同一時(shí)間，與正常組對(duì)比，UVB組經(jīng)過(guò)照射后呈現(xiàn)出皮膚顏色變紅、松弛、明顯干燥、脫屑、粗糙，并且出現(xiàn)皺紋。UVB+水母雪蓮組較UVB組來(lái)說(shuō)，皮膚完整光滑無(wú)皺紋，無(wú)紅腫和色素沉著，皮膚緊致，無(wú)脫屑、出血現(xiàn)象。

2.2 對(duì)小鼠皮膚含水量的影響：如圖2所示，與正常組比較，UVB組皮膚含水量明顯降低（65.28% vs 59.39%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與UVB組比較，UVB+水母雪蓮組皮膚含水量明顯升高（59.39% vs 63.28%，P<0.05）。

2.3 小鼠皮膚組織HE染色結(jié)果：如圖3所示，可發(fā)現(xiàn)正常組，皮膚結(jié)構(gòu)完整，光滑，排列緊密;UVB組較正常組，表皮層異常增厚，角質(zhì)層脫落嚴(yán)重，真皮層膠原纖維及彈力纖維缺失、斷裂卷曲、結(jié)構(gòu)松散、排列紊亂。相對(duì)于UVB組，UVB+水母雪蓮組表皮無(wú)異常增厚，角質(zhì)層相對(duì)完整真皮層排列有序，無(wú)錯(cuò)亂。

2.4 小鼠皮膚組織Masson染色結(jié)果：如圖4所示，可發(fā)現(xiàn)UVB組，表皮與真皮層界限模糊，真皮層厚度明顯變小，膠原纖維含量減少，甚至出現(xiàn)空洞;膠原纖維分布不均，含量減少，出現(xiàn)斷裂，排列紊亂。UVB+水母雪蓮組真皮層厚度正常，膠原纖維分布均勻，排列緊密整齊。

2.5 對(duì)小鼠水通道蛋白3通路的影響：如圖5所示，UVB組P-EGFR與P-ERK的蛋白表達(dá)量要高于正常組，AQP3的表達(dá)量低于正常組;UVB+水母雪蓮組P-EGFR與P-ERK的表達(dá)量低于UVB組，AQP3的表達(dá)量高于UVB組。

2.6 免疫組化：如圖6～7所示，UVB組AQP3的陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域明顯低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;UVB+水母雪蓮組AQP3的陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域高于UVB組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3? 討論

青海省作為中國(guó)的高海拔地區(qū)，紫外輻射極強(qiáng)，當(dāng)?shù)鼐用耖L(zhǎng)期生活在此環(huán)境中抵抗力低，受到紫外線直接照射后，容易引起一系列的疾病，尤其是光損傷性皮膚病。簡(jiǎn)便，有效的預(yù)防與治療方法是人們迫切需要的[11-12]。水通道蛋白（AQPs）是促進(jìn)水通過(guò)細(xì)胞膜的通道，其中AQP3是皮膚中最豐富的AQP，在表皮的棘層和基底層大量表達(dá)，起著水和甘油轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用[13]。AQP3運(yùn)輸?shù)母视驮诮琴|(zhì)層水化中發(fā)揮重要作用，通過(guò)促進(jìn)各種脂類的生物合成，改善屏障功能和加強(qiáng)皮膚修復(fù)能力，所以筆者通過(guò)AQP3通路治療光老化損傷是一種新的嘗試。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)注射D-半乳糖和UVB照射的聯(lián)合作用下，最大限度地制作了小鼠皮膚衰老模型[14]。經(jīng)過(guò)水母雪蓮多糖治療的UVB+水母雪蓮組小鼠，皮膚較UVB組損傷小，皮膚色澤均勻，光滑不粗糙，無(wú)脫屑，結(jié)痂等癥狀，皮膚含水量提升明顯。在HE染色下，UVB+水母雪蓮組的表皮層與真皮層界限清晰，表皮無(wú)異常增厚，且恢復(fù)了真皮層正常厚度。在Masson染色下，UVB+水母雪蓮組小鼠膠原纖維與彈性纖維，排列整齊，缺失與斷裂情況大幅度降低。這證實(shí)了水母雪蓮多糖能有效修復(fù)皮膚真皮與表皮層的損傷。

據(jù)國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，紫外線照射可以通過(guò)活化大量ERK，減少AQP3來(lái)?yè)p傷皮膚組織，造成皮膚光老化[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)處理后的UVB組，EGFR磷酸化而激活，進(jìn)而激活ERK引起一系列皮膚氧化損傷，導(dǎo)致膠原蛋白等降解，皮膚屏障功能衰退。同時(shí)AQP3的表達(dá)在皮膚的棘層與基底層也降低，使皮膚含水量降低，皮膚穩(wěn)態(tài)失衡，傷口的愈合能力顯著下降。UVB+水母雪蓮組EGFR與ERK的表達(dá)水平低于UVB組，AQP3的表達(dá)水平高于UVB組，得到了很好的恢復(fù)。這更加證明了藥物有很好的療效。水母雪蓮多糖通過(guò)使EGFR，ERK的減少，AQP3的增多抵御了皮膚的衰老與損傷。但是這個(gè)結(jié)論和部分學(xué)者[16-17]的結(jié)論有些許出入，ERK到AQP3通路的具體機(jī)制還不清晰，特別是在皮膚組織上的相關(guān)信號(hào)通路還有待鉆研。如今，對(duì)于光老化方面的研究越來(lái)越多，但是對(duì)更加深入的具體機(jī)制研究尚且不足，這個(gè)也是后續(xù)研究要去努力探索的方向。

水母雪蓮多糖通過(guò)抑制ERK活性，上調(diào)AQP3的表達(dá)量與活性，從而改變皮膚表皮與真皮層厚度、纖維形態(tài)來(lái)起到治療皮膚衰老，加強(qiáng)皮膚屏障功能作用，且AQP3在防御皮膚光老化方面起到了重要作用。作為人類使用的光老化預(yù)防劑，植物抗氧化劑和天然化合物受到了相當(dāng)大的關(guān)注，本次研究也為防紫外線藥物的研發(fā)提供了新的方向與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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[收稿日期]2020-11-09

本文引用格式：曾智，孔悅，郭硯.水母雪蓮多糖對(duì)UVB誘導(dǎo)的小鼠皮膚損傷保護(hù)作用的機(jī)制研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2021，30（4）：102-106.