郭 華 陳月華 宋慧鵬 張 慧

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116000

糖尿病是目前臨床無法完全治愈的慢性高血糖疾病，由胰島素分泌不足和胰島素拮抗或兩者共同引起[1]。糖尿病大多是因遺傳或生活習(xí)慣不良導(dǎo)致的，其引起的并發(fā)癥對(duì)人體器官影響范圍較大，屬于高發(fā)病率和高致死率的疾病之一[2]。據(jù)有關(guān)統(tǒng)計(jì)，如今全球糖尿病患者的數(shù)量已超過4億，而且發(fā)病群體逐漸趨于低齡化，這將對(duì)整個(gè)社會(huì)的發(fā)展造成一定的影響[3]。目前，臨床上治療糖尿病的藥物有雙胍類和格列奈類等，而作用靶點(diǎn)單一、耐藥性和副作用等一直是難以規(guī)避的問題[4]。因此，尋找安全、低毒、高效的藥物是目前藥學(xué)研究的主要任務(wù)。

枳實(shí)是蕓香科柑橘屬藥材，屬于理氣藥?，F(xiàn)代研究表明枳實(shí)含有黃酮類、萜類和揮發(fā)油類等多種化學(xué)成分[5]。藥理學(xué)研究表明其具有抗腫瘤、抗氧化、促進(jìn)脂質(zhì)代謝和降血糖等多種藥理作用[6]。如今枳實(shí)在中醫(yī)臨床上用以治療糖尿病及其并發(fā)癥的方藥中較為常見，但其藥效成分、作用機(jī)制尚未見報(bào)道。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是近年來新興起的用以研究藥物與疾病關(guān)聯(lián)的方法，其是在大數(shù)據(jù)背景下通過綜合多學(xué)科建立藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，系統(tǒng)地研究藥物對(duì)疾病的干預(yù)和影響，更直觀地體現(xiàn)中藥材多成分-多靶點(diǎn)-多通路的作用特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于中藥研究領(lǐng)域[7]。夏珊等[8]利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)研究了益智仁治療阿爾茲海默癥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)益智仁中白楊素、原兒茶酸、圓柚酮等可能通過抗炎、促進(jìn)細(xì)胞增殖分化等方面治療阿爾茲海默癥。賈成軍等[9]應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)對(duì)崗松揮發(fā)油的藥效組分、藥理作用及其作用機(jī)制進(jìn)行了研究。

1 材料和方法

1.1 枳實(shí)中活性成分篩選及其作用靶點(diǎn)收集

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)（traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP）數(shù)據(jù)庫收載了藥材、化學(xué)成分、藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和作用靶點(diǎn)等數(shù)據(jù)，為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究提供了數(shù)據(jù)支持。通過檢索枳實(shí)，獲得所有的化學(xué)成分，以“口服生物利用度（oral bioavailability，OB） ≥ 20% 和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18”為標(biāo)準(zhǔn)初步篩選出可能的活性成分。收集活性成分的作用靶點(diǎn)，通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（UniProt）進(jìn)行基因注釋并剔除重復(fù)、非人源靶點(diǎn)，將靶點(diǎn)名稱轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的基因名稱。

1.2 疾病靶點(diǎn)的收集及其與藥物靶點(diǎn)取交集

分別在GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索“diabetes”，獲得疾病相關(guān)靶基因。整合兩個(gè)數(shù)據(jù)庫獲得的基因，去除重復(fù)項(xiàng)，作為疾病靶基因。取藥物靶基因和疾病靶基因的交集部分作為枳實(shí)治療糖尿病的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行深入研究。

1.3 枳實(shí)-活性成分-靶點(diǎn)-糖尿病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

去除與糖尿病靶基因無關(guān)聯(lián)的化學(xué)成分，將枳實(shí)活性成分及其與糖尿病交集靶點(diǎn)等數(shù)據(jù)上傳至Cytoscape軟件，構(gòu)建枳實(shí)-活性成分-靶點(diǎn)-糖尿病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 枳實(shí)與糖尿病交集靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

STRING數(shù)據(jù)庫綜合了大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)資料，被廣泛用于研究蛋白之間相互作用。將枳實(shí)-糖尿病交集靶點(diǎn)數(shù)據(jù)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫，研究物種選擇“Homo sapiens”，其他條件默認(rèn)，進(jìn)行分析。

1.5 基因本體和京都基因與基因組百科全書富集分析

利用R語言在Bioconductor平臺(tái)對(duì)枳實(shí)與糖尿病的交集靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能注釋和基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集（P≤ 0.05）分析，并將結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 枳實(shí)中的活性成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索枳實(shí)，共獲得65個(gè)化學(xué)成分，限定OB和DL的值后共篩選出30個(gè)活性成分，見表1。通過蛋白數(shù)據(jù)庫將化合物靶點(diǎn)與人類基因匹配后，共得到133個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)。

表1 枳實(shí)的活性成分信息

2.2 糖尿病疾病靶點(diǎn)收集及其與活性成分靶點(diǎn)交集可視化

以“diabetes” 為 檢 索 詞 在 GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索。從GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索得到13784個(gè)基因，以“相關(guān)性得分＞5”作為篩選條件，最終獲得1748個(gè)基因。從OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索獲得2577個(gè)基因。整合檢索結(jié)果，去除重復(fù)項(xiàng)，共獲得疾病靶基因3305個(gè)。將活性成分靶基因和疾病靶基因兩者取交集，交集部分則為枳實(shí)與糖尿病關(guān)聯(lián)的靶基因，即枳實(shí)治療糖尿病可能的作用靶點(diǎn)。枳實(shí)中活性成分與糖尿病交集靶點(diǎn)共有95個(gè)，見圖1。

圖1 枳實(shí)中活性成分與糖尿病靶點(diǎn)的韋恩圖

2.3 “枳實(shí)-活性成分-作用靶點(diǎn)-糖尿病”宏觀網(wǎng)絡(luò)圖

整個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖共有119個(gè)節(jié)點(diǎn)，包括1個(gè)藥材節(jié)點(diǎn)（矩形圖標(biāo)），1個(gè)疾病節(jié)點(diǎn)（V形圖標(biāo)），22個(gè)活性成分節(jié)點(diǎn)（菱形圖標(biāo)）和95個(gè)靶基因節(jié)點(diǎn)（橢圓形圖標(biāo)），見圖2。該體系共包含356條邊，每條邊代表兩節(jié)點(diǎn)之間的相互關(guān)聯(lián)。其中化合物 21（芹菜素）、19（木犀草素）、17（川陳皮素）和14（柚皮素）與靶基因節(jié)點(diǎn)之間的連線較多，提示這4個(gè)化合物可能是枳實(shí)治療糖尿病的主要成分。

圖2 枳實(shí)-活性成分-糖尿病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.4 枳實(shí)-糖尿病交集靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

95個(gè)交集靶點(diǎn)之間共生成1435條蛋白相互作用連線，見圖3。不同的線條表示不同的互作類型，平均節(jié)點(diǎn)度值為30.2。篩選連線較多的前30個(gè)基因進(jìn)行分析，見圖4。提示INS、AKT1、IL6、MAPK3、JUN、MAPK1、VEGFA、CASP3、MAPK8和PTGS2等可能是枳實(shí)治療糖尿病的核心靶點(diǎn)。

圖3 枳實(shí)與糖尿病交集靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 枳實(shí)與糖尿病交集靶點(diǎn)中前30個(gè)核心基因（橫坐標(biāo)：蛋白互作連線的數(shù)目）

2.5 GO功能注釋和KEGG通路富集分析

枳實(shí)與糖尿病交集靶點(diǎn)的GO功能注釋結(jié)果顯示與104個(gè)分子功能相關(guān)（P＜0.05），就前20條進(jìn)行分析。交集靶點(diǎn)涉及的分子功能按照P值由小到大、自上而下排列，見圖5。P值越小，該功能顯著性越高。交集靶點(diǎn)主要影響RNA聚合酶II-特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活性、配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白磷酸酶結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合和類泛素蛋白連接酶結(jié)合等。KEGG通路富集結(jié)果共映射出162條通路（P＜0.05），就前20條通路進(jìn)行分析，見圖6。橫坐標(biāo)表示該通路富集靶點(diǎn)的個(gè)數(shù)，不同通路按照P值由小到大，自上而下排列，P值越小，表示該條通路顯著性越高。結(jié)果顯示這些交集靶點(diǎn)可能通過調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、白細(xì)胞介素-17（interleuk-17，IL-17）信號(hào)通路、FOXO信號(hào)通路和AGE-RAGE介導(dǎo)的信號(hào)通路等發(fā)揮糖尿病治療作用。值得注意的是，枳實(shí)可能對(duì)前列腺癌、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、結(jié)直腸癌和乙型肝炎等抗癌通路具有調(diào)控作用。

圖5 枳實(shí)與糖尿病交集靶點(diǎn)的GO分子功能分析（橫坐標(biāo)：基因富集的數(shù)目）

圖6 枳實(shí)與糖尿病交集靶點(diǎn)KEGG富集分析（橫坐標(biāo)：基因富集的數(shù)目）

3 討論

體內(nèi)外活性實(shí)驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)，不可控因素較多，獲取結(jié)果的過程較為緩慢，在一定程度上阻礙了藥物發(fā)現(xiàn)的進(jìn)程。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)是近年來新興的藥物研究手段，通過融合多學(xué)科，多數(shù)據(jù)庫進(jìn)而形成的新型生物網(wǎng)絡(luò)研究模式。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從整體的角度分析藥物與疾病之間的關(guān)聯(lián)，可以作為活性實(shí)驗(yàn)的導(dǎo)向，是尋找中藥材中活性化合物的重要輔助手段。

中醫(yī)臨床治病用藥有辨證論治，君臣佐使之說。枳實(shí)在臨床上用于治療糖尿病及并發(fā)癥的方劑中較為常見，該研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探討了枳實(shí)治療糖尿病的作用機(jī)制。通過限定化合物的OB和DL值并且取與糖尿病靶點(diǎn)具有相關(guān)性的化合物作為研究對(duì)象，結(jié)果表明枳實(shí)中含有22個(gè)成分具有潛在的治療糖尿病作用，其可能的作用靶點(diǎn)有95個(gè)。其中，芹菜素通過調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化應(yīng)激，保護(hù)胰島β細(xì)胞功能，減弱胰島素抵抗，從而產(chǎn)生治療糖尿病作用[10-11]。柚皮素不僅對(duì)胰島β細(xì)胞功能具有保護(hù)作用，還可以增強(qiáng)胰島素敏感性[12]。川陳皮素可以改善糖代謝，進(jìn)而調(diào)節(jié)血糖平衡[13]。木犀草素可能通過抑制胰腺TLR4、JNKmRNA和蛋白表達(dá)水平，從而改善胰島素抵抗，減輕胰腺炎癥反應(yīng)[14]。枳實(shí)與糖尿病交集靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果分析，提示 INS、AKT1、IL6、MAPK3、JUN、MAPK1、VEGFA、CASP3、MAPK8和 PTGS2可能是枳實(shí)發(fā)揮治療糖尿病作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。其中，INS可參與調(diào)節(jié)胰島素分泌，其基因突變會(huì)引起高胰島素血癥、高前胰島素血癥和新生兒糖尿病[15]。AKT1可參與調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)代謝，進(jìn)而維持血糖平衡，該基因的表達(dá)與胰島素敏感性有關(guān)[16]。IL-6可改善糖代謝，參與炎癥、胰島素抵抗和β細(xì)胞功能障礙等反應(yīng)[17]。MAPK3，MAPK1和MAPK8屬于一類細(xì)胞因子，可參與炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗[18]。調(diào)控VEGFA在腎小球中表達(dá)可以保護(hù)腎小球微血管系統(tǒng)，減少糖尿病對(duì)腎臟造成的損傷[19]。CASP3與細(xì)胞凋亡有關(guān)，抑制該蛋白的表達(dá)可以減少心肌或腎臟等細(xì)胞損傷[20]。PTGS2可以產(chǎn)生前列腺素，進(jìn)而負(fù)向調(diào)節(jié)葡萄糖刺激和胰島素分泌，也可以作為炎癥反應(yīng)的中介，從而改善胰島素敏感性[21]。

GO結(jié)果分析顯示，枳實(shí)與糖尿病交集靶點(diǎn)的分子功能主要涉及RNA聚合酶Ⅱ-特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活性、配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白磷酸酶結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合和類泛素蛋白連接酶結(jié)合等。KEGG結(jié)果分析顯示，PI3K-Akt信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、FOXO信號(hào)通路和AGE-RAGE介導(dǎo)信號(hào)通路等可能是枳實(shí)治療糖尿病的關(guān)鍵通路。PI3K-Akt信號(hào)通路是胰島素發(fā)揮調(diào)節(jié)糖代謝和脂質(zhì)平衡作用的重要通路[10，22-23]。HIF-1信號(hào)通路在介導(dǎo)腎損傷中發(fā)揮重要作用，其機(jī)制可能是通過上調(diào)HO-1水平來調(diào)控線粒體動(dòng)力學(xué)[24-25]。IL-17可引起胰島素抵抗或破環(huán)胰島β細(xì)胞[26]。FOXO通路可加速脂肪代謝，保護(hù)胰島細(xì)胞，同時(shí)可以改善炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激等[27]。AGE-RAGE通路可調(diào)控 NF-κB、VGEF、TGF-β1、MCP-1等基因表達(dá)，從而減少氧化應(yīng)激損傷[28]。以上結(jié)果提示枳實(shí)從多成分、多靶點(diǎn)和多通路發(fā)揮治療糖尿病作用。

多成分、多靶點(diǎn)和多通路是中藥獨(dú)有的作用特點(diǎn)，這使得它在人類預(yù)防和治療疾病過程中發(fā)揮了重要作用。中藥是發(fā)掘安全、低毒和高效天然藥物的重要來源，其規(guī)避了作用靶點(diǎn)單一的缺點(diǎn)，多成分從整體上協(xié)同發(fā)揮療效，是近年來學(xué)術(shù)界的研究熱點(diǎn)。該研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步探討了枳實(shí)治療糖尿病的活性成分及其作用靶點(diǎn)與通路，結(jié)果表明枳實(shí)對(duì)糖尿病的關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路具有調(diào)控作用，這將為后期枳實(shí)治療糖尿病的活性成分開發(fā)及藥理機(jī)制研究提供參考。目前該研究?jī)H在大數(shù)據(jù)背景下探索了枳實(shí)治療糖尿病可能的活性成分及其作用機(jī)理，后期仍需開展體內(nèi)外活性實(shí)驗(yàn)對(duì)結(jié)果的可靠性加以驗(yàn)證。