李 芳 趙 楠 香秋梅 王 倩 鄒冰姿 宋春紅

1.北京市豐臺區(qū)婦幼保健院藥劑科，北京 100067；2.山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬中心醫(yī)院實驗動物中心，山東濟(jì)南 250031

經(jīng)前期綜合征（premenstrual syndrome，PMS）屬于中醫(yī)“經(jīng)行前后諸證”范疇，根據(jù)肝氣疏泄情況的不同，又將該病分為肝氣逆證和肝氣郁證，其中肝氣郁證患者臨床常見情緒低落、抑郁寡歡等癥狀，嚴(yán)重影響了患者的身心健康[1]。課題組前期研究證明PMS肝氣郁證抑郁樣情緒的發(fā)生與腦內(nèi)μ-阿片受體（mu opioid receptor，MOR）系統(tǒng)的異常改變密切相關(guān)[2]，舒郁膠囊及各組方成分通過不同的中樞分子作用機(jī)制干預(yù)PMS肝氣郁證抑郁情緒的發(fā)生[3]，能顯著性改變PMS肝氣郁證模型大鼠海馬及下丘腦MOR蛋白表達(dá)水平[4-5]。但在PMS模型大鼠額葉、杏仁核、海馬及下丘腦組織MOR基因分布與定量表達(dá)方面的研究未見報道，MOR基因表達(dá)的改變是否跟前期報道的蛋白表達(dá)水平相一致，又是如何影響PMS肝氣郁證模型大鼠的抑郁樣情緒？這些均是需要繼續(xù)探討的問題，本實驗以PMS肝氣郁證大鼠為動物模型，用舒郁膠囊進(jìn)行藥物干預(yù)，利用原位雜交技術(shù)和實時熒光定量PCR技術(shù)分別對大鼠不同腦區(qū)MOR基因進(jìn)行定性和定量檢測，旨在探討舒郁膠囊在μ-阿片受體基因水平改善PMS抑郁樣行為的中樞作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 動 物 Wistar大鼠 48只，SPF級，體重（170±10）g，雌性，未孕，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK（京）2012-0001]。

1.1.2 藥品與試劑 鹽酸納洛酮注射液（山東新華制藥股份有限公司，批號1912092）；舒郁膠囊（青島海川創(chuàng)新生物天然藥物研究中心，批號2010L11169）；Trizol（上海生工，批號 13112605Y）；DNA試劑盒（Takara公司，Cat.No.9761）；Realtime PCR Master Mix （TOYOBO，批號056700）；MOR-mRNA探針及引物由山東瓏泰生物科技有限公司合成。

1.1.3 儀器 曠場監(jiān)控裝置（上海欣軟信息科技有限公司）、紫外分光光度計（Jenway公司），冰凍切片機(jī)（德國Leica公司），高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司），梯度PCR擴(kuò)增儀（日本Takara公司），核酸蛋白測定儀（德國Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 曠場試驗 大鼠造模開始前和造模5 d后，根據(jù)文獻(xiàn)[6]實驗步驟進(jìn)行曠場實驗，攝像系統(tǒng)自動記錄大鼠活動的水平得分和垂直得分，以水平得分與垂直得分之和作為大鼠活動的總分?jǐn)?shù)進(jìn)行行為學(xué)評價。

1.2.2 PMS肝氣郁證大鼠模型制備及分組 Wistar大鼠48只隨機(jī)分為四組，每組中的6只用于原位雜交實驗，另外6只大鼠用于實時熒光定量PCR實驗。正常組：不進(jìn)行任何外界刺激，自由活動，給予無菌水10 ml/（kg·d）灌胃；PMS肝氣郁證組：結(jié)合文獻(xiàn)[3]方法進(jìn)行慢性束縛應(yīng)激刺激，給予同體積無菌水10 ml/（kg·d）灌胃；舒郁膠囊組（舒郁組）：造模刺激同時灌胃給藥舒郁膠囊內(nèi)容物 0.408 g/（kg·d）；納洛酮組：造模刺激同時腹腔注射納洛酮10 mg/（kg·d）。

1.2.3 原位雜交法檢測MOR在海馬腦區(qū)的分布 末次給藥2 h后，將用于原位雜交實驗的大鼠麻醉后進(jìn)行心臟灌流，斷頭并取出實驗所需要的腦組織，置于固定液中固定，過夜后換為30%蔗糖，4℃至組織塊沉底；處理后的組織應(yīng)用OCT包埋，LEICA冷凍切片機(jī)切片，切片厚度為25 μm。將待測組織切片置適宜溫度用DEPC-PBS液洗片，用蛋白酶K緩沖液消化后，充分洗滌，加入預(yù)雜交液63～65℃預(yù)雜交3～4 h，將含探針的雜交液加在切片上，80～100 μl/片；雜交爐內(nèi)65℃預(yù)雜交，PBT沖洗，然后滴加抗地高辛抗體，室溫下孵育3 h；PBT沖洗后加入顯色液；終止顯色反應(yīng)后沖洗；多聚甲醛固定；PBS漂洗；封片，拍照。

1.2.4 大鼠海馬、額葉、下丘腦及杏仁核MOR基因檢測 將用于實時熒光定量實驗的各組大鼠斷頭處死，在冰塊上快速剝離額葉、海馬、下丘腦及杏仁核組織。按照RNA提取試劑盒說明書提取組織總RNA，核酸蛋白測定儀檢測總RNA濃度，后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下：95℃預(yù)變性 4 min；94℃變性 20 s；56℃退火25 s；72℃延伸35 s；共37個循環(huán)。引物序列：MOR：F：5'-GAAAACTTCAAGCGATGCTTCA-3'，R：5'-ACTCGAGTGGAGTTTTGCTGTTC-3'，GAPDH：F：5'-ATCAACGGGAAACCCATCAC-3'，R：5'-GACATACTCAGCACCAGCATCAC-3'，由 山東瓏泰生物科技有限公司合成。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 曠場實驗總得分結(jié)果

大鼠造模前曠場實驗總得分差異無統(tǒng)計學(xué)意義，PMS肝氣郁證模型組大鼠經(jīng)過5 d慢性束縛應(yīng)激后，與正常組比較，PMS肝氣郁證模型組曠場實驗總得分顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），而灌胃舒郁膠囊和納洛酮組大鼠與模型組比較明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖1。

圖1 各組大鼠造模前后曠場實驗總得分（n=12）

2.2 海馬組織MOR基因原位雜交

利用地高辛標(biāo)記探針來檢測MOR基因在海馬腦區(qū)中的定位情況，見圖2，MOR基因在海馬腦區(qū)分布較廣，多形層、輻射層和分子層均具有分布，但是在模型組大鼠的海馬腦區(qū)MOR基因表達(dá)顯著增加，而舒郁組和納洛酮組顯著減少。

圖2 MOR基因在海馬區(qū)的定位（原位雜交，×100）

2.3 各組大鼠海馬、額葉、下丘腦、杏仁核MOR基因表達(dá)比較

與正常組比較，PMS肝氣郁證模型組海馬、額葉、下丘腦、杏仁核MOR基因表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）；與模型組比較，納洛酮組大鼠額葉腦區(qū)MOR基因表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.055），這可能與樣本數(shù)量有關(guān)；納洛酮干預(yù)組大鼠其他各相應(yīng)腦區(qū)MOR基因表達(dá)水平均顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；舒郁組大鼠海馬、額葉、下丘腦和杏仁核MOR基因表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05），見圖3。

圖3 MOR基因在大鼠不同腦區(qū)中的表達(dá)

3 討論

PMS肝氣郁證患者經(jīng)前期的主要癥狀是抑郁樣情緒，慢性束縛應(yīng)激刺激能模擬較為完整的“興趣缺失”[7]狀態(tài)，自由活動愿望受挫，慢慢對周圍環(huán)境反應(yīng)的敏感度下降，在連續(xù)的束縛刺激后，大鼠逐漸出現(xiàn)眼神呆滯、行動遲緩、精神萎靡等一系列抑郁樣表征特點[8]，與課題組前期觀察一致。同時，模型大鼠的行為學(xué)指標(biāo)（曠場實驗總得分）也能客觀地反映出該動物模型的整體變化特點，能折射出其細(xì)微的心理活動變化。PMS肝氣郁征模型大鼠曠場實驗總得分顯著性降低，這表明該模型制備方法可以成功地誘導(dǎo)出模型大鼠的抑郁樣癥狀，而舒郁膠囊及納洛酮能夠有效預(yù)防束縛刺激所導(dǎo)致的抑郁樣情緒，這與前期舒郁膠囊能夠糾正抑郁樣情緒的研究也相吻合[2]。

中醫(yī)認(rèn)為PMS肝氣郁證情志不舒、氣機(jī)不暢，逐漸累及腦竅，腦神紊亂進(jìn)而影響人體臟腑功能，病機(jī)以腦神失養(yǎng)，肝失疏泄為主[9]。課題組通過fMRI技術(shù)更加進(jìn)一步證實了肝主疏泄調(diào)暢情志與腦中樞密切相關(guān)，其中PMS肝氣郁證患者發(fā)病的腦區(qū)主要涉額葉、邊緣葉（丘腦、海馬、杏仁核等）、基底核、小腦等腦區(qū)[10-11]。有研究顯示，MOR主要分布于中樞系統(tǒng)情緒調(diào)控相關(guān)的區(qū)域，且MOR系統(tǒng)及相關(guān)內(nèi)源性配體在情緒調(diào)控和情志行為疾病方面發(fā)揮重要作用，皮質(zhì)和皮質(zhì)下區(qū)域、杏仁核、海馬等腦區(qū)的MOR表達(dá)失調(diào)與亞臨床范圍內(nèi)的抑郁和焦慮癥患者情緒有關(guān)[11-12]。本實驗PMS肝氣郁證模型大鼠組海馬、額葉、下丘腦、杏仁核MOR基因過量表達(dá)，這與μ-阿片受體基因敲除小鼠表現(xiàn)出減輕的抑郁樣行為研究[13]及Yamamoto等[14]選擇大鼠束縛實驗結(jié)果（短期刺激模型大鼠下丘腦和中腦內(nèi)MOR表達(dá)上調(diào)）相一致。這提示PMS肝氣郁證的發(fā)生可能與這些腦區(qū)的MOR基因表達(dá)異常有關(guān)。課題組前期研究證實的PMS肝氣郁證模型大鼠下丘腦和海馬MOR蛋白表達(dá)水平上調(diào)[2，4-5]，這可能是由于MOR基因表達(dá)升高所致。此外，外界環(huán)境對非接收期雌性大鼠的應(yīng)激刺激，更加可能促使大鼠內(nèi)源性肽類、雌孕激素水平或其他類神經(jīng)遞質(zhì)等化學(xué)物質(zhì)發(fā)生異常變化，促使與MOR發(fā)生異常結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致MOR基因表達(dá)上調(diào)，從而產(chǎn)生類似于經(jīng)前期婦女的抑郁樣情緒。

本研究結(jié)果提示，舒郁膠囊能夠發(fā)揮MOR拮抗劑納洛酮的作用，能夠拮抗各腦區(qū)異常增高的MOR基因表達(dá)，課題組前期研究證明舒郁膠囊通過下調(diào)部分腦區(qū)的MOR蛋白表達(dá)水平而發(fā)揮其抗抑郁樣作用[2，13]，這提示舒郁膠囊可能通過降低MOR基因表達(dá)而下調(diào)MOR蛋白表達(dá)水平，從而影響了MOR相關(guān)的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通道。研究顯示，舒郁膠囊及其主成分柴胡皂苷和白芍提取物可抑制Cak1.2，調(diào)節(jié)鈣調(diào)蛋白/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ信號通道[15]，調(diào)節(jié)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)受體5-HT1AR及介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通道[16]、5-HT3離子通道[3]，而發(fā)揮其抗抑郁樣作用；白芍提取物能夠拮抗PMS焦慮模型大鼠異常表達(dá)的雌激素受體（ERβ）、色氨酸羥化酶-2（TPH2）和血清素轉(zhuǎn)運體（SERT）[17]；芍藥醇能夠改變PMDD大鼠模型異常攻擊和焦慮行為[18]。由此推測，PMS肝氣郁證模型大鼠血中或者腦內(nèi)的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和雌激素及受體、相關(guān)的信號轉(zhuǎn)道通道或離子通道異?？赡軙?dǎo)致MOR與配體的結(jié)合活性發(fā)生改變，或?qū)е翸OR相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通道發(fā)生改變，在相互作用下改變了MOR基因表達(dá)；舒郁膠囊進(jìn)入體內(nèi)后，多種物質(zhì)基礎(chǔ)成分直接作用于不同的靶點組織，或藥物的代謝產(chǎn)物發(fā)揮其生物活性，通過多通道多種機(jī)制共同拮抗異常的MOR基因表達(dá)。此外，也有可能舒郁膠囊中的某一化學(xué)成分或者代謝產(chǎn)物與納洛酮有著相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，能競爭性拮抗各類阿片受體，這或許是其發(fā)揮抗抑郁作用的中樞機(jī)制之一。

從以上研究可以看出，海馬、額葉、下丘腦及杏仁核作為重要腦區(qū)介入了MOR相關(guān)的PMS肝氣郁證抑郁樣情緒的發(fā)病機(jī)制，其他腦區(qū)是不是也介入了該發(fā)病機(jī)制，并且MOR基因改變?nèi)绾斡绊懥讼鄳?yīng)腦區(qū)的MOR相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通道，與前期研究的指標(biāo)變化又有著怎樣的聯(lián)系，這些需要在以后的研究中繼續(xù)探索驗證。同樣，盡管已經(jīng)證明舒郁膠囊可以通過改變MOR基因表達(dá)水平而發(fā)揮其抗抑郁樣作用，但是缺乏各組分的對照研究，需要在MOR基因表達(dá)水平繼續(xù)研究探討白芍提取物、柴胡提取物、香附提取物和甘草提取物的抗抑郁樣作用機(jī)制，甚至可以更精準(zhǔn)地探討某一化學(xué)成分如柴胡皂苷或者芍藥苷在MOR基因表達(dá)水平的抗抑郁樣作用。