付嬈，張海洋，梁曉艷，李萌，李俊林，宋延靜，李茹霞，王向譽(yù)

（山東省蠶業(yè)研究所，山東 煙臺 264002）

我國鹽堿地總面積約9 900萬hm2，約占全國陸地面積的10.3%，主要分布在東北西部、西北、華北和濱海地區(qū)，并以每年1.5%的速度增長［1］。改造治理及合理開發(fā)利用這一重要的后備土地資源，對改善生態(tài)環(huán)境、保障我國耕地和糧食生產(chǎn)安全和實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展等具有重大意義［2］。大部分鹽堿地區(qū)土壤瘠薄、水資源匱乏、鹽堿化程度高、自然植被稀少、生態(tài)脆弱，眾多鹽堿土治理措施中通過建植適宜的耐鹽堿植物來減少土壤含鹽量和改善土壤結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為是最具潛力且綠色的改良利用途徑［3］。保護(hù)和挖掘利用耐鹽堿植物種質(zhì)資源，對于鹽堿地改良利用具有十分重要的意義，但目前該方面研究更多集中于鹽生植物資源，而對不同種類及不同耐鹽堿植物資源的耐鹽堿特性和利用方式的研究還相對匱乏，對其抗逆機(jī)制還知之甚少。

鹽分和干旱脅迫作為鹽堿地區(qū)最常見的非生物脅迫，易造成植物生理、分子和代謝水平的顯著變化，嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育和產(chǎn)量。植物在鹽、旱脅迫下體內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），包括過氧化氫、氫氧根離子、超氧陰離子等?；钚匝踉隗w內(nèi)的大量累積會對植物產(chǎn)生毒害作用，引起膜脂過氧化作用，導(dǎo)致膜選擇透過性喪失，大量積累有害物質(zhì)［4，5］。為了阻止過度的ROS積累對細(xì)胞的毒害作用，植物形成了一系列精細(xì)的活性氧清除系統(tǒng)，包括一些抗氧化酶及抗氧化物質(zhì)，它們亦是反映植物抗性的重要指標(biāo)［6，7］。其中最主要的抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）等，它們可以幫助細(xì)胞清除大量活性氧自由基，降低其對膜系統(tǒng)造成的傷害［8，9］。丙二醛（MDA）是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，其含量高低能反映膜脂過氧化作用的強(qiáng)弱和受傷害程度的大小，可將其作為衡量植物抗旱耐鹽性的重要指標(biāo)之一［10］。植物在遭受逆境脅迫時通過主動積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來提高細(xì)胞液濃度，維持細(xì)胞膨壓和細(xì)胞內(nèi)生理過程的正常進(jìn)行，其中可溶性蛋白是植物調(diào)節(jié)自身細(xì)胞滲透勢的重要物質(zhì)之一，其含量高低直接影響植物對水分的吸收與利用［11］。

心葉日中花，又名穿心蓮，原產(chǎn)南部非洲，中國引進(jìn)栽培。它為多年生常綠草本，既能賞花又能觀葉，適合戶外造景及室內(nèi)綠化；亦是一種高產(chǎn)高效的綠葉蔬菜，其嫩莖葉具有獨(dú)特的口感和較高的營養(yǎng)價值，是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ男屡d蔬菜，市場前景廣闊［12］。心葉日中花與耐旱耐鹽堿蔬菜——冰葉日中花（別名“冰菜”）同屬于番杏科日中花屬，對于鹽脅迫有較快的反應(yīng)機(jī)制，有較強(qiáng)的耐鹽性，屬于較耐鹽植物［13］。前期引種栽培中發(fā)現(xiàn)，心葉日中花具有很強(qiáng)的耐旱性，持續(xù)干旱脅迫下植株莖稈老化枯萎并提早進(jìn)入生殖生長狀態(tài)，但在水分供應(yīng)恢復(fù)后，植株能恢復(fù)到營養(yǎng)生長狀態(tài)。鑒于此，本研究將心葉日中花作為鹽堿地改良利用的一個耐鹽堿植物種質(zhì)資源，以其扦插苗為試材，設(shè)置NaCl溶液（模擬單鹽脅迫）、海水（模擬復(fù)合鹽脅迫）和PEG－6000（模擬干旱脅迫）處理，測定其在不同脅迫時間下葉片的SOD、POD、CAT活性，以及MDA、可溶性蛋白含量的變化情況，研究其耐鹽抗旱生理機(jī)制，以期為該植物鹽堿地種植及產(chǎn)量提高提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與脅迫處理

剪取長勢良好且大小一致的心葉日中花嫩枝，扦插于裝有珍珠巖的穴盤中，再放在人工氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為（22±3）℃，光照強(qiáng)度為30～40μmol／（m2·s），光周期為14 h光照／10 h黑暗。3周后待其根系生長良好時，進(jìn)行鹽脅迫和干旱處理，分別設(shè)對照組（CK）：用蒸餾水澆灌；單鹽脅迫組（NaCl）：用300 mmol／L NaCl溶液澆灌；復(fù)合鹽脅迫組（MW）：用18‰鹽濃度海水（天然海水與蒸餾水混合）澆灌；干旱脅迫組（PEG）：用30% PEG－6000溶液澆灌。每處理重復(fù)3次。分別于處理后0、1、2、3 d和7 d取樣。取樣時選取長勢相同的3～5片葉，包于標(biāo)記好的錫箔紙中，隨即放入液氮中冷凍固定，置于－80℃超低溫冰箱中保存。待樣品全部取完后進(jìn)行生理指標(biāo)測定。

1.2 生理指標(biāo)測定

酶液制備：稱取0.5 g葉片于－20℃預(yù)冷的研缽中，加入4℃預(yù)冷的0.05 mmol／L磷酸緩沖液（pH＝7.8）5 mL冰浴研磨，然后10 000 r／min離心20 min，取上清液，4℃下保存。

酶活性測定：超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用氮藍(lán)四唑法［14］；過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚法［15］；過氧化氫酶（CAT）活性測定參照王學(xué)奎等［16］的方法；丙二醛（MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸法［17］；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)比色法［14］。所有樣品的吸光度值均用島津UV－2550紫外可見光光度計(jì)進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2010整理數(shù)據(jù)并繪制圖表，SPSS 20軟件進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽和干旱脅迫對心葉日中花超氧化物歧化酶活性的影響

由圖1可見，心葉日中花葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性，對照0～7 d間無顯著變化（P＞0.05）。單鹽（NaCl）處理，隨脅迫時間延長葉片SOD活性總體呈先升高后下降趨勢，與0 d相比，脅迫1、2、3 d時SOD活性分別升高18.41%、10.31%和15.47%，7 d時SOD活性下降16.48%。復(fù)合鹽（海水）脅迫處理1 d時SOD活性最高，比0 d升高71.99%，隨后活性降低但仍高于0 d，2、3 d和7 d時分別比0 d升高23.15%、39.10%和24.49%。PEG脅迫處理，SOD活性總體呈先升高后下降的趨勢，3 d時SOD活性最高，與0 d相比升高44.70%。

圖1 不同處理心葉日中花葉片SOD活性變化

2.2 鹽和干旱脅迫對心葉日中花過氧化物酶活性的影響

由圖2可見，心葉日中花葉片過氧化物酶（POD）活性，對照0～7 d間無顯著變化（P＞0.05）；鹽和干旱脅迫下，不同處理天數(shù)的POD活性與0 d相比差異顯著（P＜0.05）。單鹽（NaCl）處理，隨脅迫時間延長，POD活性總體呈先升高后下降趨勢，與0 d時相比，1、2、3 d和7 d時分別升高72.70%、42.43%、33.55%和23.36%。復(fù)合鹽（海水）脅迫后，POD活性呈先上升后下降趨勢，與0 d時相比，1、2、3 d和7 d分別升高90.49%、52.11%、39.79%和40.49%。PEG脅迫處理下，POD活性呈逐漸升高趨勢，與0 d時相比，1、2、3 d和7 d分別升高33.33%、31.87%、54.21%和56.41%。

圖2 不同處理心葉日中花葉片POD活性變化

2.3 鹽和干旱脅迫對心葉日中花過氧化氫酶活性的影響

由圖3可見，心葉日中花葉片的過氧化氫酶（CAT）活性，對照0～7 d間無顯著變化（P＞0.05）。單鹽（NaCl）處理，隨脅迫時間延長，CAT活性總體呈先升高后下降趨勢，1 d時活性最高，與0 d相比升高152.0%；1 d后酶活性開始下降，至7 d時與0 d相近。復(fù)合鹽（海水）脅迫處理后，CAT活性總體呈先緩慢上升后下降趨勢，與0 d時相比，1、2 d和3 d分別升高123.81%、138.10%和71.43%，7 d時活性略低于0 d。PEG脅迫處理后，CAT活性總體呈先上升后下降趨勢，與0 d時相比，1、2 d和3 d分別升高43.48%、86.96%和69.57%，7 d時活性略低于0 d。

圖3 不同處理心葉日中花葉片CAT活性變化

2.4 鹽和干旱脅迫對心葉日中花丙二醛含量的影響

由圖4可見，心葉日中花葉片丙二醛（MDA）含量，對照0～7 d間無顯著變化（P＞0.05）；鹽和干旱脅迫下，不同處理天數(shù)的MDA含量均高于0 d（P＜0.05）。單鹽（NaCl）處理，隨脅迫時間延長，MDA含量呈現(xiàn)明顯持續(xù)上升趨勢，處理1、2、3 d和7 d時分別比0 d上升123.07%、154.59%、138.20%和165.67%。復(fù)合鹽（海水）脅迫處理后，MDA含量總體呈逐漸升高趨勢，1、2、3 d和7 d時分別比0 d上升184.69%、243.52%、268.39%和277.58%。PEG脅迫處理后，MDA含量亦呈逐漸升高趨勢，1、2、3 d和7 d時分別比0 d上升160.95%、166.32%、155.16%和177.86%。

圖4 不同處理心葉日中花葉片MDA含量變化

2.5 鹽和干旱脅迫對心葉日中花可溶性蛋白含量的影響

由圖5可見，心葉日中花葉片可溶性蛋白含量，對照0～7 d間無顯著變化（P＞0.05）；鹽和干旱脅迫下，不同處理天數(shù)的可溶性蛋白含量均高于0 d。單鹽（NaCl）處理，隨脅迫時間延長，可溶性蛋白含量呈先升后降趨勢，1、2、3 d和7 d時分別比0 d升高139.67%、52.89%、33.06%和68.60%。復(fù)合鹽（海水）脅迫處理后，可溶性蛋白含量總體呈先升后降趨勢，1～3 d顯著增加，7 d時則趨近于0 d。PEG脅迫處理后，可溶性蛋白含量同樣呈先升高后下降趨勢，1、2、3 d和7 d時分別比0 d升高209.60%、225.60%、143.20%和119.20%。

圖5 不同處理心葉日中花葉片可溶性蛋白含量變化

3 討論與結(jié)論

在環(huán)境脅迫下，植物可以維持較高水平的抗氧化酶活性，消除活性氧自由基以減少其傷害［18］。MDA是膜脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，與膜滲透性密切相關(guān)，膜脂過氧化可增加膜的通透性并促進(jìn)水解作用，從而增加電導(dǎo)率［19］。有研究表明，PEG－4000模擬干旱和NaCl脅迫條件下，馬鈴薯試管苗SOD和CAT活性顯著增強(qiáng)，其MDA含量迅速增加，一定程度上緩解了干旱和高鹽脅迫的傷害［20］。鹽脅迫下，冰葉日中花葉片中的SOD和CAT活性均表現(xiàn)出上升趨勢，因此推測抗氧化酶降低細(xì)胞內(nèi)的過氧化作用，提高冰葉日中花的耐鹽性［21］。雖然植物在受到脅迫時能夠啟動自身的酶系統(tǒng)來抵御不良環(huán)境，但也僅限于一定的脅迫范圍內(nèi)，當(dāng)鹽脅迫濃度過大時，酶活性下降，從而對植物造成傷害［6］。本試驗(yàn)中，在NaCl、海水和PEG脅迫下，心葉日中花葉片SOD、POD和CAT活性顯著增加，表明這三種酶都參與了活性氧清除，以抵抗離子毒害和失水傷害；但當(dāng)脅迫時間持續(xù)增加時，葉片SOD、POD和CAT活性下降，而丙二醛含量則呈顯著上升趨勢。這些結(jié)果表明，植物的抗氧化系統(tǒng)在長時間缺水和高鹽脅迫環(huán)境下，體內(nèi)SOD、POD和CAT活性的增加還不足以消除過量的ROS，從而誘發(fā)植物葉片活性氧的積累，造成氧化脅迫，引起膜脂過氧化反應(yīng)，MDA大量產(chǎn)生，細(xì)胞膜損傷。

可溶性蛋白是植物重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，能提高細(xì)胞的保水能力，對細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起保護(hù)作用，植物通過累積可溶性蛋白使?jié)B透勢降低的方式來進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)，緩解鹽或干旱脅迫導(dǎo)致的離子毒性和生理干旱［22，23］。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)受到NaCl、海水和PEG脅迫時，心葉日中花葉片的可溶性蛋白含量均先顯著增加，表明在逆境條件下新的蛋白質(zhì)被誘導(dǎo)合成，并參與到細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)以及增強(qiáng)保護(hù)酶、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成酶的活性，繼而提高細(xì)胞的保水能力，使細(xì)胞內(nèi)外的水分達(dá)到一個平衡狀態(tài)，來消減鹽和干旱脅迫對細(xì)胞造成的損害。但長時間受到鹽和干旱脅迫時，可溶性蛋白含量開始下降，表明心葉日中花的滲透調(diào)節(jié)能力受到抑制，無法合成新的可溶性蛋白，植物無法通過自身調(diào)節(jié)來消除逆境傷害。

本試驗(yàn)分別用NaCl和海水模擬單鹽和復(fù)合鹽脅迫，發(fā)現(xiàn)兩種脅迫所引起的SOD、POD、CAT活性升高，MDA含量增加以及可溶性蛋白含量的變化趨勢是一致的，但海水脅迫下植物葉片的這些生理響應(yīng)要遲于NaCl脅迫。如：NaCl脅迫后SOD活性迅速增加，1 d時達(dá)到最大值，2～7 d活性值與1 d時相比呈下降趨勢；但海水脅迫下1～3 d緩慢增加至活性最大值，然后再呈下降趨勢。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是，NaCl單鹽溶液會對植物生長產(chǎn)生強(qiáng)烈抑制作用甚至是毒害效果，即單鹽毒害，而海水中除了Na＋還有其它一些陽離子，如K＋等，產(chǎn)生了離子拮抗作用，從而減緩鹽脅迫作用［24］。

綜上所述，心葉日中花在遭受高鹽和干旱脅迫時，超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶活性增強(qiáng)，丙二醛含量大量積累，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性蛋白含量明顯增加，使高鹽和干旱逆境對植株損害降到最低，表現(xiàn)出一定程度的鹽和干旱脅迫耐受性。但長時間暴露于高鹽和干旱逆境中時，植株體內(nèi)抗氧化酶活性的增加量不足以消除過量ROS時，植物的自我調(diào)節(jié)能力喪失，活性氧產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡被打破，活性氧在細(xì)胞內(nèi)大量積累，導(dǎo)致膜脂過氧化，膜功能受損，植物生長受到抑制。今后，在本試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們將進(jìn)一步探討心葉日中花抗鹽耐旱的生理和分子機(jī)制，更廣泛地調(diào)查收集保存和評價耐鹽堿植物品種，研究其耐鹽范圍和耐鹽機(jī)理，以便能搭配合理的耕作栽培措施，綜合改良利用鹽堿地。